ABSTRAK
Elisitor memainkan peran penting dalam sistem pertahanan tanaman, yang sering kali mengarah pada peningkatan senyawa sekunder di berbagai spesies. Tujuan dari makalah ini adalah untuk menilai efek elisitor asam salisilat (SA) dan kitosan (CTS) yang diaplikasikan pada daun terhadap komposisi minyak atsiri (EO) Achillea gypsicola dan beberapa terpenoid dan aktivitas biologis. Perlakuan dengan SA pada dosis 0, 0,5, 2, dan 8 mM, dan CTS pada 0, 2, 4, dan 8 g L −1 dievaluasi. Dua panen dilakukan antara tahun 2021 dan 2022. Elisitor SA pada 8 mM dan CTS pada 2 g L −1 menyebabkan peningkatan produktivitas EO. Aplikasi elisitor, khususnya pada dosis 2 mM SA dan 4 g L −1 CTS di A. gypsicola , berpotensi untuk merangsang produksi kamper. Selain itu, TPC dan TFC adalah yang tertinggi dalam perlakuan SA 2 mM dan CTS 8 g L −1 . Analisis LC–MS/MS menunjukkan bahwa sintesis kamper dan 1,8-sineol meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol, dengan peningkatan masing-masing sebesar 213,2% pada 8 g L −1 CTS dan 125,1% pada 4 g L −1 CTS. EO khususnya efektif terhadap Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus , dan Listeria monocytogenes .

1 Pendahuluan
Genus Achillea mencakup 115 spesies di seluruh dunia, dengan 59 spesies ditemukan di Turki, 31 di antaranya endemik (Açıkgöz 2020 ). Genus ini terdiri dari tanaman tahunan yang dikenal karena bunga harumnya dan tersebar luas di Eropa, Timur Tengah, dan Anatolia. Analisis fitokimia tanaman ini memainkan peran penting dalam studi pendahuluan farmasi dan pengobatan (Açıkgöz et al. 2022 , 2023 ). Hingga saat ini, penelitian telah menunjukkan bahwa spesies dalam genus Achillea memiliki efek antimikroba, antioksidan, antidiabetik, dan antiinflamasi (Farajpour et al. 2024 ; Huang et al. 2024 ; Kbaydet et al. 2024 ). Terungkap bahwa senyawa utama minyak atsiri (EO) genus ini adalah senyawa bioaktif seperti borneol, 1,8 cineole, dan santolina alcohol (Vojoudi et al. 2024 ) α-bisabolol (Ilardi et al. 2024 ) kamper, nerolidol, dan piperiton (Niazipoor et al. 2024 ) α-terpineol, caryophyllene, dan chamazulene (Yapar et al. 2024 ) dengan korelasi signifikan senyawa ini di antara spesies Achillea dalam penelitian sebelumnya. Seperti dicatat oleh Amssayef et al. ( 2024 ), Gabbanini et al. ( 2024 ), Ilardi et al. ( 2024 ), dan Raudone et al. ( 2024 ), sementara penelitian ekstensif telah dilakukan pada komposisi dan proses biologis EO pada tanaman, fokus utama adalah pada kandungan EO karena signifikansi ekonominya. Keuntungan kesehatan dari tanaman obat dan aromatik (MAP) tidak terbatas pada EO mereka; mereka juga mencakup senyawa fenolik (Najafian et al. 2022 ; Kemal et al. 2023 ). Meskipun banyak penelitian tentang tanaman, terdapat kekurangan informasi tentang peningkatan kadar senyawa fenolik dan peningkatan kapasitas antioksidan A. gypsicola melalui praktik kultur, dengan sebagian besar penelitian terbatas pada sistem kultur in vitro. Senyawa fenolik, termasuk asam fenolik dan flavonoid, adalah metabolit sekunder (SM) yang dipamerkan di bagian tanaman yang tidak mudah menguap. Metabolit ini dikenal karena aktivitas biologisnya yang beragam, seperti sifat antioksidan dan antimikroba (Betlej et al. 2023 ), antiinflamasi (Ugbogu et al. 2024 ), dan antikanker (Ay et al. 2023a ). Senyawa fenolik juga menghambat enzim seperti lipase pankreas, α-Glukosidase, dan α-Amilase (Tundis et al. 2023 ). Berkat karakteristik yang bermanfaat ini, senyawa fenolik banyak digunakan dalam industri kosmetik (Ben Hsouna et al. 2023 ), farmasi (Gharsallah et al. 2023 ), dan makanan (Gholamipourfard et al. 2021 ). Kadar dan jenis senyawa bioaktif ini dalam tanaman obat dan aromatik (MAP) dapat bervariasi berdasarkan faktor-faktor seperti tahap pertumbuhan tanaman (Açıkgöz 2019 ), susunan genetik, kondisi iklim (Sharma et al. 2019 ), bahan lingkungan (Pant et al. 2021 ), teknik ekstraksi (Zengin et al. 2023 ), metode budidaya, dan bagian tanaman yang digunakan (Ay et al. 2023a , 2023b ). Dengan demikian, penerapan praktik yang mempertimbangkan faktor-faktor ini dapat meningkatkan sintesis SM ke tingkat yang diinginkan. Misalnya, memahami metabolit mana yang disintesis secara inklusif pada periode tertentu dan mempromosikan tanaman dengan nutrisi yang tepat dapat meningkatkan efisiensi metabolit ini (Dilek et al. 2022 ; Kırgeç et al. 2023 ). Di antara bio-stimulan ini, kitosan (CTS) dan asam salisilat (SA) telah menarik perhatian yang signifikan baru-baru ini. Polimer alami, seperti CTS, memiliki aplikasi yang luas dalam industri makanan dan pertanian karena sifatnya yang terbarukan, biodegradabilitas, biokompatibilitas, dan biaya rendah (Zaini et al. 2024 ). CTS, yang berasal dari deasetilasi kitin yang ditemukan di eksoskeleton kepiting, udang, dan krustasea, adalah polimer yang paling banyak digunakan kedua setelah selulosa (Nath et al. 2024 ). Kelarutannya yang tinggi dalam air dan biokompatibilitasnya (Mirbagheri et al. 2024 ) telah menyebabkan peningkatan penggunaannya sebagai stimulan dan biostimulan pada tanaman (Rani et al. 2023 ; Shrestha et al. 2023 ; Stasińska-Jakubas et al. 2024 ), membuatnya populer dalam praktik pertanian organik dalam sistem pertanian berkelanjutan (Dhiman et al. 2023 ; Riseh et al. 2023 ; Sun et al. 2023 ; Medeiros et al. 2024 ). SA sangat penting untuk pertahanan tanaman terhadap patogen dan dapat diproduksi melalui jalur fenilalanin atau isokorismat (Açıkgöz 2019 ). Bila digunakan secara eksternal, SA menimbulkan respons yang mirip dengan respons yang diaktifkan oleh serangan patogen atau faktor eksternal lainnya (Mishra et al. 2024 ; Zou et al. 2024 ). Hormon ini memicu jalur pensinyalan yang mengaktifkan perekaman berbagai gen, yang menyebabkan penumpukan senyawa terkait pertahanan seperti alkaloid, terpenoid, dan polifenol (Li et al. 2024 ).

A. gypsicola , yang terdaftar sebagai rentan dalam Buku Data, adalah spesies endemik Anatolia Tengah di Turki. Tanaman ini memiliki sifat antioksidan dan antimikroba dan terdiri dari kamper, 1,8-sineol, borneol, menton, dan mentol, yang digunakan untuk berbagai keperluan dalam industri kosmetik dan farmasi. Hingga saat ini, penyelidikan telah mengungkap fitur spesies ini, seperti akumulasi SM dalam kultur suspensi sel (Açıkgöz 2019 ), aktivitas antimikroba, dan komposisi kimia dari ekstraksi dan EO bagian udara (Açıkgöz 2019 , 2020 ). Hingga saat ini, belum ada penelitian yang bertujuan untuk meningkatkan komposisi fitokimia dan sifat biologis A. gypsicola .

Tampaknya informasi tentang A. gypsicola cukup terbatas. Jumlah beberapa produk ini ditentukan dengan mengumpulkan metabolit sekunder spesies ini dari alam dan menentukannya secara kualitatif dan kuantitatif. Mengingat terbatasnya informasi tentang budidaya A. gypsicola , penelitian ini penting untuk menentukan pengaruh praktik budaya terhadap spesies tersebut. Selain itu, peningkatan metabolit sekunder tertentu melalui praktik budaya sangat penting untuk manfaat farmakologisnya. Dengan demikian, penelitian ini bertujuan untuk (1) menilai dampak pada komponen minyak atsiri SA dan CTS, (2) menyelidiki variasi kandungan fenolik dan flavonoid total, (3) mengidentifikasi perubahan kadar borneol, kamper, dan 1,8-sineol, dan (4) mengevaluasi kapasitas antioksidan dan aktivitas antimikroba.

2 Bahan dan Metode
2.1 Deskripsi Lapangan dan Desain Eksperimen
Benih yarrow ( Achillea gypsicola Hub. Mor.) diperoleh dari Departemen Tanaman Pangan di Universitas Ordu. Spesies ini diidentifikasi oleh Assoc. Prof. Dr. Sevda Türkiş dari Universitas Ordu. Spesimen voucher, bernomor 5810, disimpan di Herbarium Departemen Biologi di Universitas Gazi, Ankara, Turki. Benih dikumpulkan pada tanggal 11 Agustus 2020, kemudian dibersihkan dan disimpan dalam kantong kain vakum pada suhu +4°C. Percobaan lapangan dimulai pada tahun 2020 di Corum–Iskilip, Turki (lintang 40°44′ LU, bujur 34°28′ BT). Benih ditanam pada kedalaman 3–4 cm. Tanah memiliki tekstur lempung ringan dengan pH 8,78, konduktivitas listrik (EC) 0,447 dS m −1 , kandungan bahan organik 0,12%, kadar kalium (K) dan fosfor (P) tersedia masing-masing 72 dan 1,7 mg kg −1 , dan kandungan nitrogen total (N) 0,015%. SA diaplikasikan ke tanaman pada tiga konsentrasi: 0 (air 90% + etanol 10%), larutan 0,5, 2, dan 8-mM (b/v%). Demikian pula, CTS diaplikasikan pada tiga konsentrasi berbeda: 0 (air 90% + etanol 10%), 2, 4, dan 8 g L −1 . Larutan stok untuk kedua perlakuan disiapkan dan diaplikasikan secara terpisah melalui penyemprotan daun pada periode pembungaan penuh (9 Juni 2021 dan 13 Juni 2022). Karakteristik iklim lokasi percobaan dirinci dalam Tabel 1. Panen dilakukan pada tanggal 22 Agustus 2022, dengan 15 tanaman yang diambil sampelnya. Tanaman dikeringkan pada suhu 22°C–24°C di area teduh yang berventilasi baik, kemudian digiling menjadi bubuk halus menggunakan mixer. Penelitian ini mengikuti rancangan blok acak lengkap dengan empat kali ulangan.

TABEL 1. Hasil karakteristik iklim lokasi percobaan.

2.2 Bahan Kimia
Bahan kimia berikut bersumber dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO): Asam tiobarbiturat TBA – Sigma T5500, etanol Sigma 32221, Nomor CAS: 64-17-5, Trolox Sigma-Aldrich 238813, Nomor CAS: 53188-07-1, aluminium klorida AlCl3 , kitosan ( C6H11O4N ) n Sigma, Nomor CAS: 9012-76-4, dikalium hidrogen ortofosfat K2HPO4 Sigma P5504, Nomor CAS : 16788-57-1, kalium dihidrogen fosfat KH2PO4 – Sigma P5655 , Nomor CAS: 7778-77-0, guaiakol Sigma G5502, Nomor CAS : 90-05-1, glasial asam asetat Sigma 27225, hidrogen peroksida H 2 O 2 – Sigma 18304, CAS No: 7722-84-1, dan kalium iodida KI – Sigma 793582, CAS No: 7681-11-0. Selain itu, reagen berikut diperoleh dari Merck (Darmstadt, Jerman): Asam salisilat HOC 6 H 4 COOH – Merck 818731, CAS No: 69-72-7, Natrium hidroksida NaOH – Merck 106462, CAS No: 1310-73-2, asam galat Merck CAS No: 149-91-7, quercetin Merck CAS No: 849061-97-8 dan natrium karbonat Na 2 CO 3 – Merck 106395, CAS No: 497-19-8.

2.3 Persiapan Ekstrak Dari Bahan Tanaman
Sampel-sampel tersebut pertama-tama dibilas dengan air keran untuk membuang residu tanah dan kemudian dibiarkan mengering di udara pada kertas pengering dalam lingkungan yang terkendali selama 2 minggu. Setelah kering, sampel yang ditandai disimpan dalam toples. Dari setiap sampel, 5 g dinilai dengan benar dan ditempatkan dalam kotak. Setiap toples kemudian diisi dengan 200 mL metanol, dan campuran tersebut dimaserasi dalam bak ultrasonik selama 3 jam. Larutan disaring untuk memisahkan cairan, dan sisanya disimpan. Akhirnya, metanol diuapkan.

2.4 Analisis Metabolit Sekunder
2.4.1 Penentuan Total Kandungan Fenolik (TPC)
TPC ekstrak metanol ditentukan menggunakan reagen Folin–Ciocalteu dan standar asam galat (GA) dari Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, AS), berdasarkan metode oleh Siddhuraju dan Manian ( 2007 ) dengan sedikit modifikasi. Dalam labu ukur, 1 mL ekstrak sampel dicampur dengan 0,3 mL larutan natrium karbonat jenuh (Na2CO3 ) dan 0,1 mL reagen Folin– Ciocalteu . Volume kemudian disesuaikan dengan air suling ganda, dan larutan diinkubasi pada suhu kamar dalam gelap selama 1 jam. TPC diukur pada 765 nm menggunakan spektrofotometer UV–tampak, dengan kurva kalibrasi dibuat menggunakan GA sebagai standar, dan hasilnya ditunjukkan sebagai mg ekuivalen asam galat (GAE) per g berat kering. Setiap pengujian dilakukan dalam rangkap tiga.

2.4.2 Penentuan Total Kandungan Flavonoid (TFC)
TFC dideteksi menggunakan versi modifikasi dari metode yang dijelaskan oleh Zhishen et al. ( 1999 ). Singkatnya, 1 mL ekstrak tanaman dicampur dengan 2 mL air suling ganda dalam sebuah tabung. Selanjutnya, 0,15 mL NaNO2 0,5 M dan 0,15 mL AlCl3 0,3 M ditambahkan . Setelah interval 5 menit, 1 mL NaOH dimasukkan ke dalam campuran. Larutan kemudian dikembangkan selama 30 menit, dan TFC dinilai pada 510 nm menggunakan spektrofotometer UV-tampak (Thermo Fisher, Model G10S-UV–Vis, AS). TFC diukur berdasarkan kurva kalibrasi standar quercetin; nilai-nilai ditampilkan sebagai mg ekuivalen quercetin (QE) per g berat kering. Semua pengujian dilakukan dalam rangkap tiga.

2.4.3 Aktivitas Antioksidan
2.4.3.1 Uji Penangkal Radikal DPPH (2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil)
Untuk mengevaluasi efektivitas suspensi dalam menetralkan radikal DPPH, 0,1 mL suspensi dicampur dengan 1 mL larutan DPPH dan 4 mL metanol. Campuran disimpan dalam gelap pada suhu kamar selama 30 menit, mengikuti metode yang dijelaskan oleh Brand-Williams et al. ( 1995 ). Absorbansi ditentukan pada 517 nm menggunakan spektrofotometer UV-tampak. Aktivitas pemulungan dicatat menggunakan rumus (%) = [1 – (A 517 nm, sampel/A 517 nm, kontrol)] × 100. Semua pengujian dilakukan dalam rangkap tiga.

2.4.3.2 Uji Khelasi Ion Ferrous
Kemampuan untuk mengkelat ion ferrous dievaluasi menggunakan metode yang diadaptasi dari Decker dan Welch ( 1990 ). Dalam pengujian ini, 1 mL sampel atau larutan sumber (berperingkat dari 25 hingga 400 μg mL −1 ) dicampur dengan 1 mL buffer asetat (0,1 M, pH 4,9) dan 0,1 mL FeCl2 ( 2 mM). Selanjutnya, 0,2 mL ferrozine (5 mM) ditambahkan. Reaksi dibiarkan berlangsung selama 30 menit pada suhu ruangan (25°C), menghasilkan kompleks berwarna ungu dengan puncak serapan pada 562 nm. Aktivitas khelasi dihitung menggunakan rumus (%) = [1 – (A 562 nm, sampel/A 562 nm, kontrol)] × 100. Semua pengujian dilakukan dalam rangkap tiga.

2.4.4 Skrining Antimikroba
2.4.4.1 Mikroorganisme yang Diuji
Sifat antimikroba dari EO dinilai terhadap berbagai 10 mikroorganisme. Efek antibakteri diperiksa pada tiga bakteri Gram-negatif: Proteus vulgaris ATCC 13315, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, dan Escherichia coli ATCC 25922, serta empat bakteri Gram-positif: Listeria monocytogenes ATCC 7644, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6059, dan Streptococcus faecalis ATCC 8043. Selain itu, aktivitas antijamur diuji pada tiga spesies jamur: Aspergillus niger ATCC 16404, Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763), dan Candida albicans ATCC 10231.

2.4.4.2 Metode Difusi Cakram
Sifat antimikroba dari EO A. gypsicola dievaluasi menggunakan metode difusi cakram, mengikuti prosedur yang dijelaskan secara rinci oleh Sacchetti et al. Awalnya, kultur induk difiksasi dengan menginokulasikan lempeng Agar Mueller Hinton dengan mikroorganisme dan menginkubasinya pada suhu 37°C selama 24 jam. Kultur jamur ditumbuhkan pada Agar Sabouraud Dextrose pada suhu 25°C selama 48 jam. Kultur bakteri dikulturkan dalam Kaldu Mueller Hinton, sedangkan kultur jamur ditumbuhkan dalam Kaldu Sabouraud Dextrose, diikuti dengan inkubasi. Cawan petri diinokulasi dengan kultur induk menggunakan media steril yang sesuai untuk mencapai konsentrasi mikroorganisme 108 unit pembentuk koloni (CFU) per mL. Dalam uji difusi cakram, cakram kertas saring steril berdiameter 6 mm dijenuhkan dengan 50 μL EO dan ditempatkan pada lempeng agar yang diinokulasi. Cakram antibiotik standar (nistatin, gentamisin, ampisilin, dan penisilin) ​​berfungsi sebagai kontrol positif untuk bakteri. Diameter zona penghambatan dihitung dalam satuan milimeter.

2.4.4.3 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)
MIC ditentukan menggunakan metode mikrodilusi dalam pelat mikrotiter 96-sumur, seperti yang diuraikan oleh Negreiros et al. ( 2016 ) dengan beberapa modifikasi. EO diencerkan secara serial untuk mencapai konsentrasi berkisar dari 1,125 hingga 144 μg mL −1 . Kemudian, 50 μL setiap EO dikombinasikan dengan 100 μL media pertumbuhan kaldu yang sesuai dalam sumur pelat mikro 96-sumur, diikuti dengan penambahan 10 μL suspensi organisme yang distandarisasi ke setiap sumur. Nilai MIC untuk gentamisin, ampisilin, nistatin, dan penisilin ditentukan dalam uji keseimbangan untuk mengendalikan kelezatan mikroorganisme.

2.4.5 Isolasi EO
EO diekstraksi dari sampel melalui hidrodistilasi menggunakan peralatan Clevenger, suatu proses yang berlangsung sekitar 3 jam. Setelah distilasi, EO dikumpulkan dalam tabung kaca gelap dan disimpan pada suhu 4°C hingga dilakukan analisis lebih lanjut. Hasil EO dihitung menggunakan rumus: Hasil EO (%)  = (massa bahan kering (g) massa EO (g) ) × 100.

2.4.5.1 Analisis Konstituen EO
EO dianalisis menggunakan Kromatografi Gas (GC) pada sistem Agilent 7890B, yang dilengkapi dengan Detektor Ionisasi Nyala (FID) dan kolom kapiler silika lebur HP-5 (30 m × id 0,25 mm; ketebalan film 0,25 μm; J & W Scientific, Folsom). Suhu oven diprogram untuk naik dari 60°C ke 240°C dengan laju 3°C per menit. Analisis dilakukan dengan injeksi terpisah (rasio terpisah 25:1), dengan FID diatur pada 265°C dan injektor pada 250°C. Sampel EO sebanyak 1 μL, yang diencerkan dengan heksana (1:10), disuntikkan ke saluran masuk GC, dengan mempertahankan laju aliran kolom sebesar 1 mL per menit. Untuk analisis Kromatografi Gas–Spektrometri Massa (GC–MS), kromatografi gas Agilent yang sama digunakan, yang dipadukan dengan detektor spektrometer massa (Model 5977 MSD) dan kolom kapiler silika lebur HP-5 MS. Helium digunakan sebagai gas pembawa, dengan tegangan ionisasi 70 eV dan suhu sumber ion 300°C. Waktu pemindaian ditetapkan pada 1 detik, yang mencakup rentang massa 40–400 sma.

2.4.5.2 Identifikasi Komponen
Komponen EO diidentifikasi dengan membandingkan indeks retensi (RI) mereka dengan n-alkana (C5–C22) seperti yang dilaporkan dalam literatur. Konfirmasi lebih lanjut dicapai dengan mencocokkan spektrum massa yang dicatat dengan spektrum massa di pustaka massa W9N11.L dari metode GC–MS dan dengan spektrum massa yang terdokumentasi (Adams 2017 ).

2.4.6 Ekstraksi Senyawa Terpenoid
Untuk menganalisis senyawa terpenoid secara kuantitatif, 10 mL campuran pelarut metanol-diklorometana dicampur dengan 0,5 g sampel yang ditimbang. Sampel kemudian diekstraksi dengan ultrasonik selama 1 jam. Supernatan dikumpulkan dan dimurnikan melalui filter 0,45 μm. Sampel yang disaring kemudian diuji menggunakan kromatografi cair–spektrometri massa tandem (LC–MS/MS) dengan modifikasi yang ditentukan.

2.4.7 Penentuan Profil Borneol, Kamper, dan 1,8-Sineol Menggunakan LC–MS/MS
Pemisahan kromatografi dilakukan menggunakan kolom analitis ODS Hypersil C18 (150 × 2 mm, 4 μm, 80 Å, Phenomenex) dari Thermo Finnigan (Dreieich, Jerman). Terpenoid dipisahkan menjadi sistem pelarut biner yang terdiri dari 0,1% asam format dalam air (pelarut X) dan 0,1% metanol (pelarut Y). Fase mobil dikembalikan ke kondisi awal dan ditahan selama 4 menit untuk kalibrasi ulang sistem sebelum injeksi berikutnya. Laju aliran dipertahankan pada 0,2 mL min −1 , dengan volume injeksi 10 μL dan suhu kolom 30°C. Sumber ion dikelola dalam mode ionisasi elektrospray positif (ESI+), dengan tegangan jarum semprot 3,5 kV. Aliran selubung dan gas tambahan masing-masing ditetapkan pada 5 dan 35 unit sembarang. Disosiasi yang diinduksi tumbukan sumber (CID) ditetapkan pada 11 V, menggunakan argon sebagai gas tumbukan pada tekanan 1,0 unit sembarang. Selama pengembangan metode, borneol, kamper, dan 1,8-sineol dipelajari dalam mode produk pemindaian penuh, menghasilkan m/z = 153 dan 135 sebagai ion yang paling menonjol. Area optimal dicapai dengan energi tumbukan masing-masing 10 dan 11 V. Senyawa yang diberi tanda (m/z = 174) menghasilkan ion yang sesuai pada m/z = 156 dan 138, menggunakan energi tumbukan yang sama. Untuk analisis MS/MS borneol, kamper, dan 1,8-sineol, transisi massa (ion prekursor m/z/ion produk m/z) adalah 171/135 dan 171/153 untuk senyawa yang tidak berlabel, dan 174/138 dan 174/156 untuk senyawa yang berlabel. Tegangan yang diterapkan pada ion prekursor untuk menghasilkan ion produk m/z 135 atau 138 dan m/z 153 atau 156 masing-masing adalah 10 dan 11 V. Lebar puncak ditetapkan menjadi 0,7 lebar penuh pada setengah maksimum, dengan waktu pemindaian 0,2 detik per transisi dan lebar pemindaian ±0,7 sma. Standar referensi borneol, kamper, dan 1,8-sineol diperoleh dari Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, AS). Standar-standar ini direduksi untuk membuat standar kalibrasi dengan konsentrasi berkisar dari 1 hingga 200 μg mL −1 . Parameter kalibrasi eksternal dan kondisi LC–MS/MS, yang melibatkan kurva kalibrasi dan koefisien korelasi ( R 2 ), ditetapkan.

2.4.8 Analisis Statistik
Uji Levene digunakan untuk menilai kesamaan varians di antara semua nilai. Selanjutnya, Analisis Varians Satu Arah (ANOVA) dilakukan menggunakan perangkat lunak SAS-JMP (versi 10). Perbandingan rata-rata post hoc dilakukan dengan uji LSD pada tingkat keyakinan 95%, dan temuan disajikan sebagai nilai rata-rata dengan simpangan baku. Untuk mengeksplorasi hubungan antara berbagai parameter, analisis komponen utama digunakan. Koefisien korelasi Pearson antara senyawa dan kemampuan antioksidan dihitung menggunakan perangkat lunak SPSS versi 26 (Chicago, AS).

3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Hasil Minyak Atsiri (EO) (% b/b) dan Komposisi EO
Data tentang hasil dan komponen EO dari A. gypsicola yang diobati dengan SA dan CTS dirinci dalam Tabel 2. Kedua metode pengobatan menghasilkan peningkatan hasil EO dibandingkan dengan kontrol. Nilai tertinggi diperoleh dari pengobatan SA 2 mM dan CTS 4 g L −1 , dengan peningkatan masing-masing sebesar 40% dan 34,3%. Sementara hasil EO terus meningkat dengan aplikasi SA 8 mM dan CTS 8 g L −1 dibandingkan dengan kontrol, ditemukan bahwa tren peningkatan hasil berakhir. Fluktuasi hasil ini menyoroti dampak dosis SA dan CTS pada produksi minyak esensial yarrow. Dalam penelitian sebelumnya, hasil minyak A. gypsicola dari Turki dilaporkan sebesar 0,65% dan 1,20% (Açıkgöz 2019 ). Meskipun demikian, hasil ini menunjukkan variabilitas yang signifikan, berkisar antara 0,60% hingga 1,20% berdasarkan ontogenetik, morfogenetik, dan diurnal (Açıkgöz 2020 ). Selain itu, penelitian lain pada spesies Achillea telah melaporkan hasil berkisar antara 0,05% hingga 2,70% (Mohammadhosseini et al. 2017 ; Amssayef et al. 2024 ; Vojoudi et al. 2024 ). Meskipun ada banyak penelitian bahwa aplikasi SA dan CTS meningkatkan hasil minyak atsiri (El-Ziat et al. 2024 ; Medeiros et al. 2024 ), beberapa peneliti telah menyarankan bahwa aplikasi ini tidak mempengaruhi hasil minyak atsiri (Pirbalouti et al. 2019 ). Dalam penelitian ini, peningkatan penting dalam hasil EO terdeteksi di kedua aplikasi. Komposisi EO dari A. gypsicola diberikan dalam Tabel 2. Menurut analisis varians, terdapat perubahan signifikan dalam komposisi kimia EO dari perlakuan SA dan CTS. Dua puluh sembilan senyawa diidentifikasi melalui analisis komposisi EO. Proporsi senyawa-senyawa ini bervariasi antara 96,9% dan 98,63% dalam minyak yang diperoleh dari penelitian ini. Borneol, kamper, 1,8-sineol, alkohol, borneol, terpinen-4-ol, lavandulol, dan cis-4-thujanol merupakan komponen utama, tetapi persentase senyawa-senyawa ini dalam EO bervariasi tergantung pada perlakuan SA dan CTS. Sebagai hasil dari perlakuan SA dan CTS, rasio 1,8-sineol bervariasi antara 14,52% dan 40,53%, sedangkan rasio tertinggi diperoleh dari perlakuan CTS 4 g L −1 . Pada perlakuan SA 0,5 mM, rasio 1,8-cineole menurun dibandingkan dengan kontrol. Secara umum, peningkatan 1,8-cineole sebesar 87,5% diperoleh pada CTS 4 g L −1perlakuan dan 26,9% pada perlakuan SA 8 mM. Senyawa kamper berespon positif terhadap semua perlakuan dan meningkat dalam tingkat. Perlakuan yang menonjol di sini adalah dosis SA 0,5 dan 2 mM, yang memberikan peningkatan masing-masing sebesar 1,24 dan 0,78 kali lipat. Borneol tidak berespon positif terhadap semua perlakuan dan menurun secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol. Demikian pula, senyawa seperti lavandulol, cis-4-thujanol, dan terpinen-4-ol juga menurun dalam persentase dengan perlakuan tersebut. Penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa EO A. gypsicola sebagian besar mengandung cis-4-thujanol, 1,8-cineole, terpinen-4-ol, kamper, dan borneol. Selain itu, dalam penelitian ini, kamper (44%), cis-4-thujanol (5%), mentacamphor (20%), menthone (23%) dan verbenol (6%) disintesis dalam jumlah tinggi selama periode sebelum pembungaan; mentol—18,38%, 1,8-cineole—49%, dan terpinene—4% disintesis dalam jumlah tinggi selama periode pembungaan penuh; borneol (23%), terpinen <γ->(11%) dan verbenone (6%) disintesis dalam jumlah tinggi selama periode pasca-pembungaan. Namun, Penelitian telah menunjukkan bahwa konsentrasi senyawa seperti kamper, cineole, borneol, menthone, mentol, dan mentacamphor berbeda pada waktu panen. Misalnya, sementara akumulasi 1,8-sineol paling tinggi pada periode pra-pembungaan (27%), akumulasi kamper paling tinggi pada periode pasca-pembungaan (Açıkgöz 2019 , 2020 ). Kemudian lagi, akumulasi borneol paling tinggi pada periode pembungaan penuh. Studi mengonfirmasi bahwa perubahan proporsional dalam minyak atsiri tanaman obat dan aromatik dipengaruhi oleh banyak faktor seperti waktu panen dan tahap fenologi (Açıkgöz 2020 ), genetika (Sharma et al. 2019 ), kondisi lingkungan (Pant et al. 2021 ), dan proses pra dan setelah panen (Ay et al. 2023a , 2023b ). Mempertimbangkan faktor-faktor ini, mungkin saja untuk meningkatkan kualitas tanaman dengan meningkatkan senyawa bioaktif volatil atau non-volatil tanaman. Studi sebelumnya telah melaporkan kelimpahan tinggi senyawa tertentu pada spesies yang termasuk dalam genus Achillea . Misalnya, 1,8-sineol (45,2%), askaridol (43,22%), dan iso-askaridol (37,87%) diidentifikasi sebagai senyawa utama dalam Achillea biebersteinii (Mirahmadi dan Norouzi 2017 ). Dalam A. kellalensis dan A. wilhelmsii , lavandulyl asetat (26,19%) dan chamazulene (52,60%) masing-masing merupakan senyawa dominan (Ghasemi Pirbalouti 2017 ). A. wilhelmsii juga mengandung sejumlah besar kamper, 1,8-sineol, anetol, dan α-pinena. Untuk A. vermicularis, senyawa utamanya adalah 1,8-cineole, camphor, levo-carvone, dan δ-terpinene, sedangkan A. tenuifolia kaya akan β-cubebene, elixene, β-sesquiphellandrene, 1,8-cineole, camphor, dan δ-terpinene (Farajpour et al. 2024 ). Pada A. fragrancetissima , artemisia ketone (22,11%) dan β-thujone (31,86%) merupakan komponen utamanya (Alsohaili 2018 ). A. wilhelmsii juga ditemukan mengandung neoiso-dihydrocarveol asetat (25,2%), trans-piperitol (11,7%), trans-carveol (27,5%), krisantenon (38,8%), filifolon (19,7%), α-pinena (11,8%), dan (E)-nerolidol (10,8%), (E)-kariofilen (11,2%) (Saeidi et al. 2018 ). Studi pada A. gypsicola terbatas, dan sebagian besar telah dilakukan pada sampel liar. Studi ini adalah yang pertama menyelidiki sampel yang dibudidayakan, mengidentifikasi kamper (40,17%–43,53%), 1,8-sineol (22,01%–49,36%), dan borneol (9,50%–22,62%) sebagai senyawa utama (Açıkgöz 2019 , 2020 ).

 

TABEL 2. Komposisi minyak atsiri (%) dari seluruh tanaman tergantung pada tahap pembungaan penuh pada A. gypsicola (rata-rata 2 tahun).

Catatan: Nilai tebal menunjukkan perbedaan signifikan secara statistik.
a SA, Asam salisilat.
b CTS, Kitosan.
c Indeks retensi relatif terhadap n-alkana (C5-C22) pada kolom HP 5MS.
d Hasilnya dinyatakan dalam mean ± SD ( n  = 3).
e Berarti dengan huruf yang sama pada uji LSD tingkat %5 tidak bermakna.

Penelitian telah menunjukkan bahwa stimulasi dengan SA dan CTS meningkatkan komposisi dan produksi EO pada tanaman obat dan aromatik (Silva-Santos et al. 2023 ). SA memulai sintesis SM seperti minyak atsiri, protein, dan senyawa fenolik, dengan respons yang bervariasi berdasarkan spesies tanaman, dosis, dan kondisi lingkungan (Miladinova-Georgieva et al. 2022 ; Ay et al. 2023b ; Jeyasri et al. 2023 ; Kırgeç et al. 2023 ). Kitosan, suatu pemicu biotik, telah terbukti mengubah komposisi EO dalam Lippia alba dan meningkatkan sintesis senyawa tertentu (de Souza Silva et al. 2022 ). Pemicu, baik biotik maupun abiotik, memicu respons fisiologis dan morfologis pada tanaman. Misalnya, aplikasi kitosan secara signifikan meningkatkan kandungan vestitol pada daun Lotus japonicus (Trush et al. 2023 ). Efek sinergis SA dan kitosan pada produksi SM telah diamati, dengan peningkatan yang lebih besar pada kadar stevioside dan rebaudioside A pada Stevia rebaudiana dibandingkan dengan kontrol (Nawaz et al. 2023 ).

Tumbuhan memiliki reseptor yang mengenali sinyal eksternal dan mengaktifkan sistem pertahanan untuk mensintesis senyawa bioaktif melalui metabolisme sekunder. Namun, spesies MAP sering kali tidak mengakumulasi molekul bioaktif dalam jumlah yang cukup, sehingga memerlukan stimulasi untuk meningkatkan metabolisme sekunder dan menambah kandungan SM. Penelitian telah menunjukkan bahwa kitosan meningkatkan proporsi mentol dan menton (Ahmad et al. 2019 ), serta senyawa sitronelal dan geranial dalam EO (Ahmed et al. 2020 ). Aplikasi SA telah ditemukan dapat meningkatkan konsentrasi monoterpen utama dalam EO pepermin (Cappellari et al. 2019 ). Kitosan, biopolimer alami, menstimulasi biosintesis SA dan metil jasmonat, meningkatkan respons fisiologis tumbuhan melalui jalur pensinyalan transduksi stres (Açıkgöz 2019 , 2020 ). Praktik SA melalui daun secara signifikan meningkatkan kandungan seskuiterpen teroksigenasi dan hidrokarbon seskuiterpen, meskipun tidak mempengaruhi proporsi beberapa senyawa dalam EO (Medeiros et al. 2024 ).

3.2 Skrining Antimikroba
Aktivitas antimikroba dari EO A. gypsicola dievaluasi, termasuk tiga bakteri Gram-negatif, empat bakteri Gram-positif, satu ragi, dan dua jamur (Tabel 3 ). Efek penghambatan yang signifikan diamati pada E. coli (21,2 mm), P. aeruginosa (23,4 mm), dan S. aureus (28,3 mm) dengan perlakuan CTS 8 g L −1 . Aktivitas antimikroba tertinggi tercatat pada B. subtilis (28,8 mm) dengan CTS 8 g L −1 , diikuti oleh CTS 4 g L −1 (28,1 mm) dan CTS 2 g L −1 (25,8 mm). Untuk S. faecalis , L. monocytogenes , dan S. cerevisiae , perlakuan CTS 8 g L −1 menghasilkan aktivitas tertinggi (masing-masing 24,6, 29,2, dan 19,5 mm), dengan CTS 4 g L −1 juga menunjukkan hasil signifikan (masing-masing 21,8, 26,8, dan 18,1 mm). Aktivitas tertinggi terhadap C. albicans dan A. niger diamati dengan SA 2 mM (masing-masing 19,8 dan 19,2 mm). Hasil ini jauh lebih tinggi dibandingkan dengan air + etanol. Perlakuan CTS 8 g L −1 menunjukkan zona penghambatan yang lebih besar (21,2 mm) terhadap E. coli dibandingkan dengan ampisilin. Demikian pula, perlakuan CTS 8 g L −1 menunjukkan hasil yang lebih unggul terhadap P. aeruginosa dan S. aureus (masing-masing 23,4 dan 28,3 mm) dibandingkan dengan gentamisin (masing-masing 23 dan 28 mm). Konsentrasi penghambatan minimum (MIC) dari EO A. gypsicola berkisar antara 4,5 hingga 72 μg mL −1 untuk bakteri Gram-positif, 4,5–144 μg mL −1 untuk bakteri Gram-negatif, dan 18–144 μg mL −1 untuk jamur. Nilai MIC yang paling efektif diamati pada perlakuan CTS 2 dan 4 g L −1 untuk P. vulgaris (4,5 μg mL −1 ), S. aureus (4,5 μg mL −1 ), dan B. subtilis (4,5 μg mL −1 ). Perlakuan lain tidak berkinerja sebaik kontrol positif. Sejumlah penelitian telah menyoroti sifat antimikroba spesies Achillea .

TABEL 3. Zona penghambatan (IZ) dan konsentrasi penghambatan minimum (MIC) minyak esensial milik seluruh tanaman tergantung pada tahap pembungaan penuh di A. gypsicola (rata-rata 2 tahun).

Catatan: nt, belum diuji.
Diameter zona penghambatan (mm) termasuk diameter cakram 6 mm.
b Diuji pada 10 μg cakram −1 .

Titik temu dari studi-studi ini bukanlah praktik kultural, tetapi uji aktivitas antimikroba dari bahan baku yang diperoleh dari alam, baik ekstrak maupun minyak atsiri. Kita mengetahui dari studi-studi bahwa praktik kultural pada tanaman meningkatkan dan mengembangkan kualitas ekstrak tanaman atau EO (Ay et al. 2023a , 2023b ; Kırgeç et al. 2023 ). Oleh karena itu, memperluas dan menyelidiki praktik-praktik ini mungkin merupakan langkah penting terhadap mikroorganisme yang mengembangkan diri mereka sendiri dari hari ke hari. Fokus studi ini adalah hal ini dan untuk meningkatkan kandungan SM yang merupakan pertahanan penting terhadap mikroorganisme dengan perawatan SA dan CTS. Ini adalah pelepasan spesies oksigen reaktif (ROS) yang cepat dan jangka pendek, yang merupakan salah satu reaksi pertahanan awal terhadap mikroorganisme atau makro-organisme, dan ini mencakup sejumlah reaksi pertahanan. Dalam sejumlah studi yang dilakukan sejauh ini, para peneliti telah mengindikasikan bahwa SA dan kitosan memicu akumulasi SM yang disintesis dalam tanaman (Cui et al. 2024 ; Novikova et al. 2024 ). Selain itu, diketahui bahwa kitosan dapat menghambat pertumbuhan bakteri (Cheng et al. 2022 ) dengan mengkelat ion logam, dan bahwa basa Schiff asam amino salisilaldehid juga memiliki tempat pengkelat (Odularu 2022 ). Sebaliknya, telah dikonfirmasi dalam banyak studi bahwa senyawa ini berkontribusi pada pengembangan potensi antimikroba dengan meningkatkan aktivitas ROS (Açıkgöz et al. 2024 ). Lal et al. ( 2016 ) melaporkan bahwa kitosan berbasis Schiff menunjukkan efek penghambatan terhadap spesies jamur tertentu, termasuk A. niger , serta bakteri gram positif seperti B. subtilis dan S. aureus . Dalam studi lain, Piegat et al. ( 2020 ) menunjukkan bahwa turunan kitosan terasilasi NO memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli dan S. aureus menggunakan metode mikrodilusi, difusi cakram, dan perendaman agar. Demikian pula, dalam temuan kami, perawatan CTS ditampilkan secara menonjol. Attia dkk. ( 2018 ) menyoroti bahwa perawatan asam salisilat efektif terhadap spesies S. aureus , P. aeruginosa , E. coli , K. pneumoniae , dan Candida , sementara Song dkk. 2022) mengonfirmasi khasiat antibakteri dari aplikasi asam salisilat. Berbagai sifat antimikroba dari ekstrak tumbuhan atau minyak esensial terhadap mikroorganisme dapat dikaitkan dengan perbedaan kadar gabungan senyawa-senyawa ini. Variabilitas ini dapat menyebabkan senyawa-senyawa menunjukkan efek antimikroba yang lebih kuat atau lebih lemah, yang dipengaruhi oleh interaksi antagonis atau sinergisnya (Açıkgöz 2020 ). Perlu juga dicatat bahwa senyawa-senyawa ini bervariasi berdasarkan tahap-tahap vegetatif (Ay et al. 2023a ; Kırgeç et al. 2023 ). Oleh karena itu, sangat penting untuk memperkaya senyawa-senyawa ini, yang berbeda menurut banyak variabel, dengan stimulan alami dan endogen untuk memerangi mikroorganisme yang semakin resistan tanpa mencemari tanah secara berlebihan.

3.3 Total Kandungan Flavonoid dan Fenolik
Kandungan total flavonoid (TF) dan fenolik (TP) yang diperoleh dari sampel yang diobati dengan SA dan CTS pada awal periode pembungaan disajikan dalam Tabel 4. Nilai kandungan total fenolik (TPC) menunjukkan peningkatan yang signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol, tergantung pada senyawa dan dosis yang digunakan. TPC berkisar antara 330,4 hingga 468,1 mg GAE g −1 DW, dengan nilai tertinggi yang diamati pada perlakuan SA 2 mM (468,1 mg GAE g −1 DW), dibandingkan dengan kontrol (330,4 mg GAE g −1 DW). Secara khusus, TPC meningkat sebesar 45,4% dan 30,2% pada perlakuan SA 2 mM dan SA 8 mM, masing-masing, dibandingkan dengan kontrol. Meskipun peningkatan signifikan dalam TPC juga diamati pada perlakuan CTS, perlakuan SA lebih efektif. Sebaliknya, perlakuan CTS menghasilkan nilai TFC yang lebih tinggi, dengan peningkatan yang signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol. TFC berkisar antara 98,2 hingga 175,5 mg QE g −1 DW, dengan nilai tertinggi tercatat pada perlakuan CTS 8 g L −1 dan 4 g L −1 (masing-masing 175,5 dan 159,3 mg QE g −1 DW). TFC meningkat sebesar 78,7% dengan perlakuan CTS 8 g L −1 dibandingkan dengan kontrol. Sementara perlakuan SA juga meningkatkan nilai TFC secara signifikan dibandingkan dengan kontrol, perlakuan tersebut sedikit kurang efektif dibandingkan dengan perlakuan CTS. Secara umum, TPC dan TFC spesies Achillea bervariasi tergantung pada varietas/spesies, bagian tanaman, tahap perkembangan, dan praktik kultural (Binobead dan Aziz 2024 ; Bouteche et al. 2024 ; Kbaydet et al. 2024 ; Raudone et al. 2024 ; Siles-Sánchez et al. 2024 ). Peningkatan TPC tertinggi diamati dengan dosis SA 2 mM. Oleh karena itu, untuk meningkatkan sifat-sifat ini dalam A. gypsicola , aplikasi SA 2 mM dan perlakuan CTS 8 g L −1 direkomendasikan. SA dapat dipindahkan dari lokasi perlakuan ke jaringan tanaman lain, memenuhi fungsinya dalam aplikasi SA yang digunakan secara eksternal (Schweiger et al. 2014 ; Mozafari et al. 2018 ). SA, asam sinamat yang diperoleh secara organik, bertindak sebagai perantara dalam jalur asam shikimat dan berperan dalam sintesis fenolik (Hayat et al. 2007 ). Fenol digabungkan melalui jalur metabolisme asam shikimat. Efek peningkatan SA pada senyawa fenolik dalam A. gypsicola dapat dikaitkan dengan hal ini. SA adalah senyawa organik yang berfungsi sebagai pengatur pertumbuhan tanaman (Kaya et al. 2023 ).

TABEL 4. Efek asam salisilat (SA) dan kitosan (CTS) yang diaplikasikan pada A. gypsicola sebagai semprotan daun pada dosis berbeda pada tahap pembungaan penuh terhadap total fenolik (mg GAE g ⁻¹ DW), flavonoid (mg QE g ⁻¹ DW), aktivitas antioksidan (% penghambatan), borneol, kamper, dan 1,8-sineol (μg mL ⁻¹ ) (rata-rata 2 tahun).

a *Pada konsentrasi 200 μg mL −1 .
b DPPH, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil.
c nt, belum diuji.
d SA, Asam salisilat.
e CTS, Kitosan.
f Hasilnya dinyatakan sebagai rata-rata ± SD ( n  = 3).
g Berarti huruf yang sama pada uji LSD tingkat %5 tidak bermakna.

3.4 Aktivitas Antioksidan
Memeriksa kapasitas antioksidan tanaman A. gypsicola yang digunakan dengan SA dan CTS sangat penting untuk menilai kemanjuran terapeutik dari sampel-sampel ini. Kapasitas antioksidan dievaluasi menggunakan uji DPPH dan kelasi ion Ferrous, dengan hasil yang dinyatakan dalam Tabel 4. Penelitian ini menemukan korelasi yang kuat antara hasil dari dua uji kapasitas antioksidan. Perlakuan dengan CTS (8 g L −1 , 93,8%) meningkatkan aktivitas antioksidan secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol (65,9%) (Tabel 4 ). Selain itu, semua perlakuan menunjukkan aktivitas pembersihan radikal yang signifikan secara statistik. Temuan menunjukkan bahwa perlakuan SA dan CTS meningkatkan kapasitas pembersihan radikal. Lebih jauh lagi, perlakuan ini menunjukkan kapasitas antioksidan yang lebih tinggi daripada kontrol positif seperti Trolox dan BHT. Sampel yang diobati dengan CTS (8 g L −1 ) menunjukkan daya kelasi ion besi tertinggi (85,7%), diikuti oleh CTS (4 g L −1 ) dengan kemampuan kelasi 79,5%. Secara keseluruhan, kemampuan kelasi diperingkat sebagai Trolox > EDTA > BHT > CTS (8 g L −1 ) (Tabel 4 ). Hubungan antara perlakuan SA dan CTS serta SM, serta efeknya pada aktivitas antioksidan, telah disorot dalam banyak penelitian sebelumnya (Ahmed et al. 2024 ; Angouti et al. 2024 ). Stasińska-Jakubas et al. ( 2024 ) melaporkan bahwa aplikasi SA meningkatkan aktivitas ROS, sehingga meningkatkan kapasitas antioksidan dalam penelitian mereka pada Hypericum perforatum . Demikian pula, Rithichai et al. ( 2024 ) menemukan bahwa perlakuan SA 1 mM menghasilkan kapasitas antioksidan tertinggi dalam Ocimum sanctum , sementara perlakuan SA 2 dan 2,5 mM menyebabkan penurunan kapasitas antioksidan. Penelitian ini menunjukkan bahwa stimulan SA dan CTS dapat meningkatkan kapasitas antioksidan. Selain itu, beberapa penelitian telah menekankan bahwa penggunaan pengobatan SA dan CTS, baik secara individu maupun dalam kombinasi, mendukung akumulasi SM yang efektif dalam meningkatkan kapasitas antioksidan (Das et al. 2024 ; Tabassum et al. 2024 ; Wang et al. 2024 ; Yin et al. 2024 ). Hasil penelitian ini konsisten dengan literatur terkini. Temuan dari penelitian ini menyoroti efek signifikan pengobatan SA dan CTS pada A. gypsicola dan menunjukkan bahwa stimulan ini berpotensi meningkatkan aktivitas antioksidan.

3.5 Profil Terpenoid dan Penentuan Korelasi Antara Hasil yang Diperoleh Menggunakan Korelasi Pearson dan Analisis Komponen Utama (PCA)
Kuantifikasi borneol, kamper, dan 1,8-sineol dilakukan menggunakan analisis LC–MS/MS, dan hasilnya dinyatakan dalam μg mL −1 . Efek aplikasi SA dan CTS yang digunakan pada A. gypsicola untuk pengumpulan terpenoid ditunjukkan pada Tabel 4 . Dengan demikian, kadar borneol, kamper, dan 1,8-sineol tertinggi diperoleh dari perlakuan SA 2 mM, CTS 8 g L −1 , dan CTS 8 g L −1 , dengan peningkatan masing-masing sebesar 0,62 kali lipat (dari 37,20 menjadi 60,19 μg mL −1 ), 2,13 kali lipat (dari 63,4 menjadi 198,6 μg/mL), dan 1,25 kali lipat (dari 78,1 menjadi 175,8 μg/mL) (Tabel 4 ). Kadar borneol meningkat pada perlakuan SA 0,5 dan 2 mM dibandingkan dengan kelompok kontrol, dan peningkatan ini berhenti pada perlakuan SA 8 mM dan berada pada kelompok statistik yang sama dengan kelompok kontrol. Berdasarkan hasil ini, perlakuan 8 mM dapat dilihat sebagai nilai batas. Berlawanan dengan situasi ini, tidak ada dosis batas yang tercapai pada kamper dan 1,8-sineol, dan peningkatan jumlah kedua senyawa berlanjut pada dosis yang berbeda. Sementara CTS adalah perlakuan yang menonjol dalam jumlah kamper dan 1,8-sineol di antara semua perlakuan, perlakuan SA adalah perlakuan yang dominan dalam senyawa borneol. Dalam penelitian sebelumnya yang dilakukan pada terpenoid borneol, kamper, dan 1,8-sineol, para peneliti umumnya berfokus pada rasio persentase mereka dalam minyak esensial (El-Esawi et al. 2017 ; Gorni et al. 2020 ). Es-sbihi et al. ( 2020 ) menyatakan dalam penelitian mereka pada Salvia officinalis bahwa perlakuan SA meningkatkan rasio kamper dan 1,8-sineol dalam minyak esensial. Dalam penelitian lain, Abbaszadeh et al. ( 2020 ) melaporkan bahwa perlakuan SA pada Rosmarinus officinalis meningkatkan proporsi borneol, kamper, dan 1,8-sineol dalam minyak esensial. Demikian pula, Khodadadi et al. ( 2022 ) melaporkan dalam penelitian mereka tentang Salvia abrotanoides dan Salvia yangii bahwa perlakuan CTS meningkatkan proporsi senyawa-senyawa ini dalam minyak atsiri dalam kondisi stres. Oleh karena itu, sangat sedikit penelitian yang menyelidiki perubahan jumlah terpena internal ini karena perlakuan SA dan CTS. Dalam penelitiannya tentang kultur suspensi sel dalam A. gypsicola , Açıkgöz ( 2017 ) melaporkan bahwa produksi kamper tertinggi dari stimulan SA dan CTS terdapat dalam sampel yang diberi perlakuan CTS. Pemuatan faktor dari PCA diperlihatkan dalam Tabel 5. PCA 1 menggambarkan 40,20% variasi data dan modifikasi sampel berdasarkan kandungan minyak atsiri cis-4-thujanol, lavandulol, terpinen-4-ol (+), dan rendemen minyak atsiri (+). PCA 2 menjelaskan 26,53% variabilitas dalam respons asli berdasarkan minyak atsiri 1,8-sineol (+), kandungan 1,8-sineol (+), TPC (+), dan TFC (+). PCA 3menjelaskan 15,43% variabilitas dalam respons asli berdasarkan minyak esensial borneol (+), kandungan borneol (+), penangkal radikal DPPH (+), dan uji kelasi ion Ferrous (+). PCA 4 hanya mencakup 9,30% variasi data, khususnya yang terkait dengan minyak esensial kamper dan kandungan kamper. Analisis PCA mengidentifikasi empat kelompok utama (PCA 1 , PCA 2 , PCA 3 , dan PCA 4 ) berdasarkan beban faktor (Tabel 5 ). Koefisien korelasi Pearson dihitung untuk memeriksa hubungan antara kandungan fenolik total (TPC), kandungan flavonoid total (TFC), terpenoid, dan aktivitas antioksidan ekstrak dari yarrow menggunakan uji kelasi ion DPPH dan Ferrous. Koefisien ini ditunjukkan pada Tabel 6 . 1,8-Cineole (%) menunjukkan korelasi positif yang kuat dengan terpinen-4-ol (%) (0,695**), 1,8-cineole (μg mL −1 ) (0,724**), kamper (μg mL −1 ) (0,679**), pembersihan radikal DPPH (0,542**), dan uji kelasi ion Ferrous (0,499**), tetapi memiliki korelasi negatif dengan TFC (−0,530**) dan TPC (−0,573**). Kamper (%) berkorelasi positif dengan borneol (%) (0,526**), kamper (μg mL −1 ) (0,852**), dan borneol (μg mL −1 ) (0,569**), tetapi berkorelasi negatif dengan cis-4-thujanol (%) (−0,385*), 1,8-sineol (μg mL −1 ) (−0,455**), dan TPC (−0,374*). Borneol (%) memiliki korelasi positif yang kuat dengan lavandulol (%) (0,653**) dan borneol (μg mL −1 ) (0,856**), tetapi korelasi negatif dengan cis-4-thujanol (%) (−0,552*), terpinen-4-ol (%) (−0,468**), dan 1,8-cineole (μg mL −1 ) (−0,642**). Cis-4-thujanol (%) berkorelasi positif dengan 1,8-cineole (μg mL −1 ) (0,680**), penangkapan radikal DPPH (0,556**), dan uji kelasi ion Ferrous (0,620**), tetapi berkorelasi negatif dengan lavandulol (%) (−0,651**), borneol (μg mL −1 ) (−0,610**), dan rendemen minyak atsiri (−0,435*). Lavandulol (%) menunjukkan korelasi positif dengan 1,8-cineole (μg mL −1 ) (0,642**), kamper (μg mL −1 ) (0,852**), dan borneol (μg mL −1 ) (0,569**), tetapi korelasi negatif dengan terpinen-4-ol (%) (−0,608**), uji kelasi ion besi (−0,422*), dan TPC (−0,520**). Terpinen-4-ol (%) berkorelasi positif dengan kamper (μg mL −1 ) (0,656**) dan uji kelasi ion besi (0,492**). 1,8-Cineole (μg mL −1 ) memiliki korelasi positif yang kuat dengan kamper (μg mL −1) (0,727**), borneol (μg mL −1 ) (0,745**), dan rendemen minyak atsiri (0,620**), tetapi berkorelasi negatif dengan TFC (−0,395**) dan TPC (−0,356*). Kamper (μg mL −1 ) berkorelasi negatif dengan TPC (−0,622**). Rendemen minyak atsiri berkorelasi positif dengan TFC (0,554**). Selain itu, uji penyingkiran radikal DPPH berkorelasi positif kuat dengan uji khelasi ion Ferrous (0,993**) dan TFC (0,518**). TFC berkorelasi positif dengan TPC (0,678**).

TABEL 5. Pembebanan faktor yang diperoleh melalui analisis komponen utama.

Singkatan: DPPH, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil.

TABEL 6. Koefisien korelasi Pearson antara senyawa bioaktif dan kapasitas antioksidan Achillea gypsicola .

Singkatan: DPPH, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil; EO, Minyak atsiri; EOY, Hasil minyak atsiri; FI, Ion besi; TFC, Total kandungan flavonoid; TPC, Total kandungan fenolik.
** dan * signifikan pada tingkat probabilitas p  ≤ 0,01 dan p  ≤ 0,05.

Analisis komponen utama dan koefisien korelasi mengindikasikan bahwa TFC, dan pada tingkat yang lebih rendah TPC, terutama bergantung pada kapasitas antioksidan yang diamati dalam sampel A. gypsicola . Data tersebut mengungkapkan bahwa proporsi senyawa seperti borneol, kamper, dan 1,8-sineol dalam minyak esensial secara signifikan memengaruhi aktivitas DPPH dan uji khelasi ion besi. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan korelasi penting antara aktivitas antioksidan dan terpenoid tertentu (Tohidi-Nejad et al. 2024 ). Misalnya, Wang et al. ( 2017 ) menemukan bahwa borneol meningkatkan kapasitas antioksidan dan memiliki aplikasi potensial dalam makanan. Demikian pula, Li et al. ( 2024 ) mengidentifikasi korelasi positif antara borneol dan aktivitas antioksidan. Seperti hasil kami, Kanyal et al. ( 2024 ) melaporkan dalam penelitian mereka bahwa monoterpen seperti borneol, kamper, dan 1,8-sineol mungkin bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan. Selain itu, penelitian ini mencatat bahwa borneol disintesis dari geranyl difosfat, prekursor monoterpena, dengan kamper juga berpartisipasi dalam jalur biosintesis yang sama (Ma et al. 2022 ). Akibatnya, temuan mengenai borneol dan kamper dalam penelitian kami menguatkan hubungan ini. Hu et al. ( 2024 ) melaporkan bahwa borneol memiliki efek antiinflamasi, analgesia, dan kemampuan untuk mengatasi hambatan biologis, selain kapasitas antioksidannya. Para peneliti melaporkan korelasi positif yang kuat antara aktivitas antioksidan dan TPC dan TFC dalam penelitian mereka (Farajpour et al. 2024 ; Ghasemi et al. 2024 ; Taibi et al. 2024). Penelitian telah menunjukkan bahwa asam salisilat yang diberikan secara eksogen berperan penting dalam mengatur ekspresi gen yang terkait dengan pertumbuhan tanaman, respons pertahanan, dan biosintesis beberapa golongan metabolit sekunder. Efek mitigasi SA pada tanaman yang mengalami stres kekeringan ditemukan terkait dengan peningkatan proses fisiologis dengan meningkatkan kandungan pigmen fotosintesis dan retensi air dalam jaringan tanaman. Kitosan adalah polisakarida kationik yang dikenal sebagai stimulator ampuh akumulasi metabolit sekunder pada tanaman. Efek menguntungkan kitosan telah diidentifikasi dalam meningkatkan toleransi tanaman terhadap stres biotik dan abiotik dan dalam mendorong produksi metabolit sekunder. Monoterpen siklik seperti borneol, kamper, dan 1,8-sineol berlimpah di alam dan sangat dihargai karena aktivitas biologisnya, termasuk efek antioksidan dan antimikroba. Terpen ini termasuk yang paling umum di alam dan umumnya digunakan sebagai bahan tambahan makanan. Baru-baru ini, mereka semakin dikenal karena efek biologisnya, termasuk aktivitas antimikroba, antiinflamasi, antiproliferatif, dan antioksidan. Senyawa berbasis alam menawarkan banyak keuntungan, karena sifat antibakteri dan antioksidan gabungannya dapat mengatasi berbagai masalah, seperti resistensi antibiotik dan dampak negatif stres oksidatif (Akacha et al. 2022 ; Ben Akacha et al. 2023a , 2023b , 2023c ; Ben Hsouna et al. 2023 ).

4 Kesimpulan
Pekerjaan ini adalah yang pertama menyelidiki efek praktik SA dan CTS pada kandungan TP dan TF, aktivitas antioksidan, komposisi minyak esensial, dan monoterpen dalam A. gypsicola . Temuan ini memberikan wawasan berharga tentang bagaimana A. gypsicola merespons berbagai perlakuan SA dan CTS, terutama ketika diterapkan selama periode pembungaan awal. Penelitian ini menyoroti potensi untuk meningkatkan kualitas fitokimia A. gypsicola . Selain itu, hal ini memajukan pemahaman kita tentang kapasitas antioksidan dinamis dan SM dari tanaman ini. Hasilnya menunjukkan bahwa memanipulasi A. gypsicola dengan SA dan CTS secara efektif dapat meningkatkan akumulasi SM. Aplikasi SA dan CTS daun terbukti menjadi metode yang sederhana dan hemat biaya untuk meningkatkan akumulasi terpenoid tertentu dalam A. gypsicola . Pendekatan ini meningkatkan kualitas hasil panen dan menunjukkan metode pemberian untuk menumbuhkan MAP dengan peningkatan kesehatan dan keuntungan farmasi. Khususnya, sintesis kamper dan 1,8-sineol meningkat masing-masing sebesar 213,2% (8 g L −1 CTS) dan 125,1% (4 g L −1 CTS). Kadar TFC dan TPC tertinggi diamati dengan perlakuan CTS 8 g L −1 dan SA 2 mM, masing-masing mencapai 175,5 mg QE g −1 DW dan 468,1 mg GAE g −1 DW. Jumlah terbesar borneol, kamper, dan 1,8-sineol dicapai dengan perlakuan SA 2 mM dan CTS 8 g L −1 , menunjukkan peningkatan masing-masing sebesar 0,62 kali lipat (dari 37,20 menjadi 60,19 μg mL −1 ), 2,13 kali lipat (dari 63,4 menjadi 198,6 μg mL −1 ), dan 1,25 kali lipat (dari 78,1 menjadi 175,8 μg mL −1 ). Perbaikan signifikan juga dicatat pada komponen esensial lainnya. Hasil kami menunjukkan bahwa aplikasi eksogen SA dan CTS tidak hanya meningkatkan unit metabolit sekunder tetapi juga berkontribusi pada peningkatan kapasitas antioksidan dalam A. gypsicola . Perlakuan SA dan CTS juga meningkatkan akumulasi beberapa senyawa dengan sifat farmakologis yang terbukti dalam A. gypsicola . Diperkirakan bahwa aplikasi SA dan CTS dapat memberikan kontribusi yang signifikan terhadap akumulasi beberapa senyawa sekunder pada tanaman bila diterapkan pada saat pembungaan penuh.