Abstrak
Enzim makanan prolil oligopeptidase (EC 3.24.21.26) diproduksi dengan galur Trichoderma reesei DP-Nyq99 yang dimodifikasi secara genetik oleh Genencor International BV. Modifikasi genetik tidak menimbulkan masalah keamanan. Enzim makanan tersebut dianggap bebas dari sel-sel yang hidup dari organisme produksi dan DNA-nya. Enzim makanan tersebut dimaksudkan untuk digunakan dalam pemrosesan sereal dan biji-bijian lainnya untuk produksi produk minuman. Paparan makanan diperkirakan mencapai 0,041 mg TOS/kg berat badan (bb) per hari pada populasi Eropa. Uji genotoksisitas tidak menunjukkan adanya masalah keamanan. Toksisitas sistemik dinilai melalui studi toksisitas oral dosis berulang selama 90 hari pada tikus. Panel mengidentifikasi tingkat efek samping yang tidak teramati sebesar 1000 mg TOS/kg berat badan (bb) per hari, dosis tertinggi yang diuji, yang jika dibandingkan dengan perkiraan paparan makanan, menghasilkan margin paparan setidaknya 24.390. Pencarian homologi urutan asam amino dari prolil oligopeptidase dengan alergen yang diketahui dilakukan dan tidak ditemukan kecocokan. Panel mempertimbangkan bahwa risiko reaksi alergi setelah paparan makanan terhadap enzim makanan tidak dapat dikesampingkan, tetapi kemungkinannya rendah. Berdasarkan data yang diberikan, Panel menyimpulkan bahwa enzim makanan ini tidak menimbulkan masalah keamanan dalam kondisi penggunaan yang dimaksudkan.

1. PENDAHULUAN
Pasal 3 Peraturan (EC) No 1332/2008 1 memberikan definisi untuk ‘enzim makanan’ dan ‘persiapan enzim makanan’.

‘Enzim pangan’ berarti suatu produk yang diperoleh dari tumbuhan, hewan atau mikroorganisme atau produk-produk dari tumbuhan, hewan atau mikroorganisme, termasuk produk yang diperoleh melalui proses fermentasi menggunakan mikroorganisme: (i) mengandung satu atau lebih enzim yang mampu mengkatalisis reaksi biokimia tertentu; dan (ii) ditambahkan ke pangan untuk tujuan teknologi pada setiap tahap pembuatan, pemrosesan, penyiapan, perlakuan, pengemasan, pengangkutan atau penyimpanan pangan.

‘Sediaan enzim pangan’ berarti suatu formulasi yang terdiri dari satu atau lebih enzim pangan yang di dalamnya zat-zat seperti bahan tambahan pangan dan/atau bahan pangan lainnya dimasukkan untuk memudahkan penyimpanan, penjualan, standarisasi, pengenceran atau pembubarannya.

Sebelum Januari 2009, enzim makanan selain yang digunakan sebagai bahan tambahan makanan tidak diatur atau diatur sebagai bahan pembantu pengolahan berdasarkan undang-undang Negara Anggota. Pada tanggal 20 Januari 2009, Peraturan (EC) No 1332/2008 tentang enzim makanan mulai berlaku. Peraturan ini berlaku untuk enzim yang ditambahkan ke makanan untuk melakukan fungsi teknologi dalam pembuatan, pengolahan, persiapan, penanganan, pengemasan, pengangkutan atau penyimpanan makanan tersebut, termasuk enzim yang digunakan sebagai bahan pembantu pengolahan. Peraturan (EC) No 1331/2008 2 menetapkan prosedur Uni Eropa (UE) untuk penilaian keamanan dan prosedur otorisasi bahan tambahan makanan, enzim makanan dan perasa makanan. Penggunaan enzim makanan hanya akan diizinkan jika dibuktikan bahwa:

• tidak menimbulkan masalah keamanan terhadap kesehatan konsumen pada tingkat penggunaan yang diusulkan;
• ada kebutuhan teknologi yang wajar;
• penggunaannya tidak menyesatkan konsumen

Semua enzim pangan yang saat ini berada di pasaran UE dan dimaksudkan untuk tetap berada di pasar tersebut, serta semua enzim pangan baru, harus menjalani evaluasi keamanan oleh Otoritas Keamanan Pangan Eropa (EFSA) dan persetujuan melalui daftar Komunitas UE.

1.1 Latar Belakang dan Kerangka Acuan sebagaimana diberikan oleh pemohon
1.1.1 Latar belakang sebagaimana diberikan oleh Komisi Eropa
Hanya enzim pangan yang termasuk dalam daftar Uni yang boleh ditempatkan di pasar dan digunakan dalam pangan, sesuai dengan spesifikasi dan ketentuan penggunaan yang diatur dalam Pasal 7(2) Peraturan (EC) No 1332/2008 tentang enzim pangan.

Pada tanggal 21 November 2023, permohonan baru telah diajukan oleh pemohon “Genencor International BV” untuk otorisasi enzim pangan Prolyl oligopeptidase dari Trichoderma reesei yang dimodifikasi secara genetik (strain DP-Nyq99).

1.1.2 Kerangka Acuan
Komisi Eropa meminta Otoritas Keamanan Pangan Eropa untuk melaksanakan penilaian keamanan dan penilaian kemungkinan permintaan kerahasiaan enzim pangan berikut: Prolyl oligopeptidase dari Trichoderma reesei yang dimodifikasi secara genetik (strain DP-Nyq99) sesuai dengan Peraturan (EC) No 1331/2008 yang menetapkan prosedur otorisasi umum untuk bahan tambahan pangan, enzim pangan, dan perasa pangan. 3

2 DATA DAN METODOLOGI
2.1 Data
Pemohon telah menyerahkan berkas yang mendukung permohonan otorisasi enzim pangan prolil oligopeptidase dari strain Trichoderma reesei DP-Nyq99.

Informasi tambahan, yang diminta dari pemohon selama proses penilaian pada tanggal 22 Oktober 2024 dan 14 Maret 2025, diterima masing-masing pada tanggal 23 Januari 2025 dan 20 Maret 2025 (lihat ‘Dokumentasi yang diberikan kepada EFSA’).

2.2 Metodologi
Penilaian dilakukan sesuai dengan prinsip-prinsip yang dijelaskan dalam ‘Panduan EFSA tentang transparansi dalam aspek ilmiah penilaian risiko’ (EFSA, 2009 ) dan mengikuti dokumen panduan yang relevan dari Komite Ilmiah EFSA.

‘Pedoman Ilmiah untuk penyerahan berkas tentang enzim pangan’ (Panel EFSA CEP, 2021 ) dan ‘Proses pembuatan pangan dan data teknis yang digunakan dalam penilaian paparan enzim pangan’ (Panel EFSA CEP, 2023 ) telah diikuti untuk evaluasi.

2.3 Konsultasi publik
Sesuai dengan Pasal 32c(2) Peraturan (EC) No 178/2002 4 dan Keputusan Direktur Eksekutif EFSA yang menetapkan pengaturan praktis mengenai fase pra-penyerahan dan konsultasi publik, EFSA melaksanakan konsultasi publik mengenai versi non-rahasia dari berkas teknis tersebut dari tanggal 10 Oktober hingga 01 November 2024. 5 Tidak ada komentar yang diterima.

3 PENILAIAN

Tata nama IUBMB	Prolil oligopeptidase
Nama sistematis	–
Sinonim	Enzim pembelahan pasca-prolin, endopeptidase prolin, endopeptidase pasca-prolin, endopeptidase spesifik prolin
IUBMB Tidak	3.4.21.26
Nomor CAS	Nomor telepon 72162-84-6
EINECS Tidak	Bahasa Indonesia

Oligopeptidase prolil mengkatalisis hidrolisis ikatan peptida pada sisi terminal-C residu prolin, dan pada tingkat yang lebih rendah residu alanin, peptida dan protein, melepaskan peptida dan asam amino. Enzim makanan yang sedang dinilai dimaksudkan untuk digunakan dalam pengolahan sereal dan biji-bijian lainnya untuk produksi produk minuman.

3.1 Sumber enzim makanan
Oligopeptidase prolil diproduksi dengan jamur berfilamen hasil rekayasa genetika Trichoderma reesei strain DP-Nyq99 (■■■■■), yang disimpan di koleksi kultur Institut Keanekaragaman Hayati Jamur Westerdijk (CBS, Belanda) dengan nomor penyimpanan ■■■■■. 6 Strain produksi diidentifikasi sebagai T. reesei melalui analisis filogenomik berdasarkan 150 protein inti yang terkonservasi. 7

Genom strain produksi dicari untuk gugus gen dengan fungsi yang diketahui, dan tidak ditemukan gugus yang terlibat dalam sintesis senyawa dengan toksisitas yang diketahui .

3.1.1 Karakteristik mikroorganisme induk dan penerima
■■■■■

■■■■■

■■■■■. 9

3.1.2 Karakteristik urutan yang diperkenalkan
■■■■■

■■■■■

■■■■■ 10

3.1.3 Deskripsi modifikasi genetik
■■■■■

■■■■■

■■■■■. 11

■■■■■. 12

3.1.4 Aspek keamanan modifikasi genetik
Berkas teknis berisi semua informasi yang diperlukan tentang mikroorganisme penerima, organisme donor, dan proses modifikasi genetik.

Galur produksi T. reesei strain DP-Nyq99 berbeda dari galur penerima ■■■■■ ■■■■■.

Tidak adanya urutan tulang punggung vektor, ■■■■■, dikonfirmasi oleh ■■■■■. 13

Tidak ada masalah yang mengkhawatirkan yang timbul dari modifikasi genetik yang diidentifikasi oleh Panel.

3.2 Produksi enzim makanan
Enzim makanan diproduksi sesuai dengan Peraturan Higiene Pangan (EC) No 852/2004 14 , dengan prosedur keamanan pangan berdasarkan Analisis Bahaya dan Titik Kendali Kritis, dan sesuai dengan praktik manufaktur yang baik saat ini. 15

Galur produksi ditumbuhkan sebagai kultur murni menggunakan media industri yang umum dalam sistem fermentasi batch atau fed-batch terendam dengan kontrol proses konvensional yang berlaku. ■■■■■ 16 , 17 ■■■■■ ■■■■■. Setelah fermentasi selesai, biomassa padat dikeluarkan dari kaldu fermentasi dengan penyaringan. Filtrat yang mengandung enzim kemudian dimurnikan dan dipekatkan lebih lanjut, termasuk langkah ultrafiltrasi di mana protein enzim dipertahankan, sementara sebagian besar bahan bermassa molekul rendah melewati membran penyaringan dan dibuang. 18 Pemohon memberikan informasi tentang identitas zat yang digunakan untuk mengendalikan fermentasi dan dalam pemrosesan hilir enzim makanan berikutnya. 19 , 20 , 21

Panel berpendapat bahwa informasi yang memadai telah diberikan mengenai proses produksi dan sistem jaminan mutu yang diterapkan pemohon untuk menyingkirkan masalah yang perlu dikhawatirkan.

3.3 Karakteristik enzim makanan
3.3.1 Sifat enzim makanan
Prolil oligopeptidase merupakan rantai polipeptida tunggal dengan ■■■■■ asam amino. 22 Massa molekul protein matang, dihitung dari urutan asam amino, adalah ■■■■■ kDa. 23 Enzim makanan dianalisis dengan elektroforesis gel poliakrilamid-natrium dodecyl sulfate. 24 Pola protein yang konsisten diamati di semua kelompok. Gel menunjukkan pita protein utama tunggal yang bermigrasi di antara protein penanda ■■■■■ dan ■■■■■ kDa.

Tidak ada aktivitas enzim lain yang dilaporkan.

Penentuan internal pemohon terhadap aktivitas prolil oligopeptidase didasarkan pada hidrolisis N-karbobenzoksi-glisina-prolin- p -nitroanilida (kondisi reaksi: pH 4,6, 30°C, 3 menit) dengan mengukur pelepasan p -nitroanilin pada 405 nm. Aktivitas enzim diukur relatif terhadap standar enzim internal dan dinyatakan dalam Unit Endopeptidase Prolin (PEPU)/g. 25 , 26

Enzim makanan memiliki suhu optimum sekitar 50–60°C (pH 4,6) dan pH optimum sekitar pH 4–5 (30°C). Termostabilitas diuji setelah pra-inkubasi enzim makanan selama 15 menit pada suhu yang berbeda (pH 4,6). Aktivitas enzim menurun di atas 55°C, tidak menunjukkan aktivitas residual pada suhu 80°C. 27

3.3.2 Parameter kimia
Data tentang parameter kimia enzim pangan disediakan untuk tiga batch yang ditujukan untuk komersialisasi, salah satunya digunakan untuk uji toksikologi (Tabel 1 ). 28 Rata-rata total padatan organik (TOS) dari ketiga batch tersebut adalah 28,1% dan rasio aktivitas enzim/TOS rata-rata adalah 0,06 PEPU/mg TOS.

TABEL 1. Komposisi enzim makanan.

Batch yang digunakan untuk studi toksikologi.
b PEPU: Unit Endopeptidase Prolin (lihat Bagian 3.3.1 ).
c TOS dihitung sebesar 100% – % air – % abu.

3.3.3 Kemurnian
Kandungan timbal dalam tiga batch komersial berada di bawah 5 mg/kg, 29 , 30 yang mematuhi spesifikasi timbal sebagaimana ditetapkan dalam spesifikasi umum untuk enzim yang digunakan dalam pengolahan pangan (FAO/WHO, 2006 ).

Enzim makanan tersebut mematuhi kriteria mikrobiologi untuk total coliform, Escherichia coli dan Salmonella , sebagaimana ditetapkan dalam spesifikasi umum untuk enzim yang digunakan dalam pengolahan makanan (FAO/WHO, 2006 ). 31 Tidak ada aktivitas antimikroba yang terdeteksi dalam satu pun kelompok yang diuji. 32

Strain Trichoderma , seperti kebanyakan jamur berfilamen, memiliki kapasitas untuk menghasilkan berbagai metabolit sekunder (Frisvad et al., 2018 ). Pemohon tidak memberikan informasi tentang potensi metabolit sekunder yang diproduksi dalam kondisi fermentasi yang dapat berkontribusi terhadap enzim makanan–TOS. Masalah ini ditangani oleh pemeriksaan toksikologi enzim makanan–TOS. 33

Panel menilai bahwa informasi yang diberikan mengenai kemurnian enzim pangan sudah memadai.

3.3.4 Sel yang layak dan DNA dari strain produksi
Tidak adanya sel-sel yang layak dari strain produksi dalam enzim pangan ditunjukkan dalam tiga kelompok independen yang dianalisis dalam rangkap tiga. ■■■■■. Tidak ada koloni yang dihasilkan. Kontrol positif disertakan. 34

Tidak adanya DNA rekombinan dalam enzim pangan ditunjukkan oleh analisis PCR dari tiga kelompok yang diuji dalam rangkap tiga. Tidak ada DNA yang terdeteksi dengan primer yang mengamplifikasi ■■■■■, dengan batas deteksi 10 ng DNA yang dipaku/g enzim pangan. 35

3.4 Data Toksikologi
Serangkaian uji toksikologi meliputi uji mutasi balik bakteri (uji Ames), uji mikronukleus sel mamalia in vitro, dan studi toksisitas oral dosis berulang selama 90 hari pada tikus telah disediakan.

Batch 3 (Tabel 1 ) yang digunakan dalam penelitian ini merupakan salah satu batch yang digunakan untuk komersialisasi dan dengan demikian dianggap cocok sebagai item uji.

3.4.1 Genotoksisitas
3.4.1.1 Uji mutasi balik bakteri
Uji mutasi balik bakteri (uji Ames) dilakukan menurut Pedoman Uji 471 Organisasi untuk Kerja Sama Ekonomi dan Pembangunan (OECD) (OECD, 2020 ) dan mengikuti praktik laboratorium yang baik (GLP). 36 Empat strain Salmonella Typhimurium (TA98, TA100, TA1535 dan TA1537) dan Escherichia coli WP2 uvrA (pKM101) digunakan dengan atau tanpa aktivasi metabolik (campuran S9), menerapkan modifikasi ‘treat and plate’ dari metode pra-inkubasi.

Percobaan toksisitas awal dilakukan secara duplikasi, menggunakan strain S. Typhimurium TA100 dan delapan konsentrasi enzim makanan berkisar antara 50 hingga 5000 μg TOS/piring. Tidak ada sitotoksisitas yang diamati pada konsentrasi zat uji apa pun.

Berdasarkan hasil ini, percobaan utama dan konfirmasi dilakukan sebanyak tiga kali, menggunakan lima konsentrasi enzim makanan (50, 158, 500, 1581 dan 5000 μg TOS/piring).

Tidak ada sitotoksisitas yang diamati pada konsentrasi zat uji apa pun. Setelah perlakuan dengan enzim makanan, tidak ada peningkatan yang relevan secara biologis dalam jumlah koloni yang kembali di atas nilai kontrol pada galur apa pun yang diuji, dengan atau tanpa campuran S9.

Studi ini dianggap dapat diandalkan tanpa batasan dan hasil negatifnya sangat relevan.

Panel menyimpulkan bahwa enzim makanan prolil oligopeptidase tidak menyebabkan mutasi gen dalam kondisi pengujian yang diterapkan dalam penelitian ini.

3.4.1.2 Uji mikronukleus sel mamalia in vitro
Uji mikronukleus sel mamalia in vitro dilakukan menurut Pedoman Uji OECD 487 (OECD, 2016 ) dan mengikuti GLP. 37 Tiga percobaan terpisah dilakukan dengan kultur duplikat limfosit darah utuh perifer manusia. Kultur sel diperlakukan dengan enzim makanan dengan atau tanpa aktivasi metabolik (campuran S9).

Dalam uji sitotoksisitas awal, tidak ada sitotoksisitas di atas 50% yang terlihat pada konsentrasi apa pun yang diuji hingga 5000 μg TOS/mL dengan dan tanpa campuran S9. Sitotoksisitas masing-masing sebesar 29%, 27% dan 36% tercatat pada konsentrasi tertinggi yang diuji dalam perawatan jangka pendek (paparan 3 jam dan periode pemulihan 21 jam) dengan dan tanpa campuran S9 dan dalam perawatan jangka panjang (paparan 24 jam tanpa periode pemulihan) tanpa campuran S9.

Dalam tiga percobaan utama, sel-sel terpapar pada enzim makanan dan dinilai berdasarkan frekuensi sel berinti dua dengan mikronuklei (MNBN) pada konsentrasi 313, 1250 dan 5000 μg TOS/mL dalam perawatan jangka pendek dengan campuran S9, dalam perawatan jangka pendek tanpa campuran S9 dan dalam perawatan jangka panjang tanpa campuran S9.

Sitotoksisitas, sebagai pengurangan Indeks Replikasi, sebesar 34%, 32% dan 38% dilaporkan pada konsentrasi tertinggi yang diuji dalam paparan jangka pendek dengan campuran S9, tanpa campuran S9 dan dalam pengobatan jangka panjang tanpa campuran S9.

Frekuensi MNBN tidak berbeda secara signifikan secara statistik dari kontrol negatif pada semua konsentrasi yang diuji.

Studi ini dianggap dapat diandalkan tanpa batasan dan hasil negatifnya sangat relevan.

Panel menyimpulkan bahwa enzim makanan prolil oligopeptidase tidak menyebabkan peningkatan frekuensi MNBN dalam kondisi pengujian yang diterapkan dalam penelitian ini.

3.4.2 Studi toksisitas oral dosis berulang selama 90 hari pada hewan pengerat
Studi toksisitas oral dosis berulang selama 90 hari dilakukan di bawah GLP dan sesuai dengan Pedoman Uji OECD 408 (OECD, 2018 ). 38

Kelompok yang terdiri dari 10 tikus Sprague–Dawley CD jantan dan 10 tikus betina menerima enzim makanan melalui gavage dengan dosis 250, 500 atau 1000 mg TOS/kg bb per hari. Kelompok kontrol menerima pembawa (air suling untuk injeksi).

Tidak ada kematian yang diamati.

Kenaikan berat badan meningkat secara signifikan secara statistik pada hari ke-36–43 pemberian pada laki-laki dosis tinggi (+56%), menurun pada hari ke-43–50 pada laki-laki dosis tinggi (−42%) dan menurun pada hari ke-36–43 pada perempuan dosis rendah dan menengah (−48% dan −49%). Panel menganggap perubahan tersebut tidak relevan secara toksikologi, karena perubahan tersebut hanya dicatat pada interval waktu tunggal, perubahan tersebut hanya diamati pada satu jenis kelamin (pada hari ke-43–50), tidak ada konsistensi antara perubahan pada laki-laki dan perempuan (pada hari ke-36–43), tidak ada hubungan dosis-respons (pada hari ke-36–43 pada perempuan) dan perubahan tersebut tidak memiliki efek signifikan secara statistik pada berat badan akhir dan/atau kenaikan berat badan akhir.

Konsumsi pakan meningkat secara signifikan secara statistik pada jantan dosis rendah dan tinggi pada hari ke 8–15 (keduanya +6%) dan 36–43 pemberian (keduanya +4%), pada hari ke 22–29, 29–36 dan 50–58 pada jantan dosis tinggi (+7%, +5% dan +4%) dan pada hari ke 64–71 dan 71–78 pada jantan dosis rendah (+4% dan +5%). Pada betina, konsumsi pakan menurun secara signifikan secara statistik pada kelompok dosis rendah dan menengah pada hari ke 8–15 (-7% dan -5%) dan 64–71 pemberian (keduanya -6%), meningkat pada hari ke 29–36 dan 50–58 pada kelompok dosis tinggi (+9% dan +4%) dan menurun pada hari ke 78–85 pemberian pada kelompok dosis rendah (-7%). Panel menganggap perubahan tersebut tidak relevan secara toksikologi, karena perubahan tersebut hanya dicatat pada interval waktu tunggal, tidak ada konsistensi antara perubahan pada jantan dan betina, perubahannya kecil (< 10%), tidak ada hubungan dosis-respons, dan tidak ada perubahan signifikan secara statistik pada konsumsi pakan akhir, berat badan, dan/atau pertambahan berat badan.

Dalam pengamatan fungsional, 39 selama pengamatan aktivitas motorik pada interval 1, peningkatan yang signifikan secara statistik dalam waktu ambulasi (+11% dan +10%) dan penurunan waktu stereotip (−77% dan −68%) pada laki-laki dosis rendah dan menengah, dan pada interval 2, penurunan waktu istirahat pada laki-laki dosis rendah (−60%) diamati. Pada wanita, terjadi peningkatan dalam waktu ambulasi pada interval 2 (keduanya +14%) dan dalam waktu ambulasi total (+10% dan +15%), dalam kelompok dosis rendah dan tinggi, penurunan waktu istirahat pada interval 2 (−63% dan -61%) dan dalam waktu istirahat total (−39% dan -55%) dalam kelompok dosis rendah dan tinggi, peningkatan waktu ambulasi pada interval 3 (+34%), dalam jarak yang ditempuh pada interval 2 (+48%) dan dalam jarak total yang ditempuh (+37%) dalam kelompok dosis tinggi, penurunan dalam waktu stereotip pada interval 3 (−58%) dan dalam waktu stereotip total (−52%) dalam kelompok dosis tinggi, penurunan waktu istirahat pada interval 1 dalam kelompok dosis rendah dan menengah (−48% dan -53%) diamati. Panel menganggap perubahan tersebut tidak relevan secara toksikologi, karena perubahan tersebut hanya dicatat pada interval waktu tunggal, perubahan tersebut hanya diamati pada satu jenis kelamin (jarak yang ditempuh, total jarak yang ditempuh) dan tidak ada hubungan dosis-respons (semua parameter kecuali waktu ambulasi dan waktu stereotip pada interval 3, jarak yang ditempuh pada interval 2, total jarak yang ditempuh, dan total waktu stereotip pada wanita).

Investigasi hematologi mengungkapkan penurunan limfosit (Limfa) yang signifikan secara statistik pada pria dosis menengah (−23%), peningkatan waktu protrombin (PT) (+23%) dan waktu tromboplastin parsial teraktivasi (APTT) (+24%) pada pria dosis rendah, peningkatan hematokrit (HCT) pada wanita dosis menengah dan tinggi (+5% dan +6%), peningkatan lebar distribusi sel darah merah (RDW) pada wanita dosis tinggi (+4%), penurunan persentase sel hiperkromik pada wanita dosis tinggi (−45%) dan peningkatan APTT pada wanita dosis rendah dan tinggi (+22% dan +21%). Panel menganggap perubahan tersebut tidak relevan secara toksikologi, karena hanya diamati pada satu jenis kelamin (semua parameter kecuali APTT), tidak ada hubungan dosis-respons (Limfa, PT, APTT), tidak ada perubahan pada parameter relevan lainnya (sel darah putih lainnya), tidak ada perubahan histopatologi pada organ atau jaringan limfohematopoietik.

Investigasi kimia klinis menunjukkan peningkatan yang signifikan secara statistik pada protein total (+6%) dan globulin (+11%) pada pria yang diberi dosis tinggi dan penurunan kalsium pada pria yang diberi dosis sedang dan tinggi (-10% dan -7%). Panel menganggap perubahan tersebut tidak relevan secara toksikologi karena hanya diamati pada satu jenis kelamin (semua parameter), tidak ada hubungan dosis-respons (kalsium), tidak ada perubahan pada parameter relevan lainnya (albumin, rasio albumin/globulin, elektrolit lainnya) dan tidak ada perubahan histopatologis pada organ yang relevan.

Perubahan signifikan secara statistik yang terdeteksi pada berat organ adalah peningkatan berat jantung relatif terhadap berat tubuh pada pria dosis sedang (+9%) dan pada wanita dosis rendah dan tinggi (+9% dan +10%) dan peningkatan berat ginjal relatif terhadap berat tubuh pada wanita dosis rendah, sedang, dan tinggi (+10%, +13%, +17%). Panel menganggap temuan tersebut tidak relevan secara toksikologi, karena hanya diamati pada satu jenis kelamin (berat ginjal relatif), tidak ada hubungan dosis-respons (berat jantung relatif) dan tidak ada temuan histopatologi pada jantung dan ginjal dan perubahan tersebut berada dalam nilai kontrol historis (semua parameter).

Tidak ada perbedaan lain yang signifikan secara statistik atau relevan secara biologis dari kontrol yang dilaporkan.

Panel mengidentifikasi tingkat tidak adanya efek buruk yang teramati (NOAEL) sebesar 1000 mg TOS/kg bb per hari, dosis tertinggi yang diuji.

3.4.3 Alergenisitas
Penilaian alergenisitas hanya mempertimbangkan enzim makanan dan tidak termasuk bahan tambahan, pembawa atau eksipien lain yang mungkin digunakan dalam formulasi akhir.

Potensi alergenisitas prolil oligopeptidase yang diproduksi dengan galur Trichoderma reesei DP-Nyq99 dinilai dengan membandingkan urutan asam aminonya dengan urutan alergen yang diketahui sebagaimana dijelaskan dalam Opini Ilmiah EFSA GMO (Panel EFSA GMO, 2010 ). Dengan menggunakan identitas lebih dari 35% dalam jendela geser 80 asam amino sebagai kriteria, tidak ditemukan kecocokan dalam basis data AllergenOnline .

Belum ada laporan yang dipublikasikan mengenai sensitisasi oral atau pernapasan atau reaksi eksitasi prolil oligopeptidase yang sedang dinilai. Belum ada reaksi alergi terhadap paparan prolil oligopeptidase melalui makanan yang dilaporkan dalam literatur. 41

Panel berpendapat bahwa hasil penelusuran homologi sekuens dan penelusuran literatur yang tersedia tidak menunjukkan risiko reaksi alergi terhadap paparan makanan terhadap prolil oligopeptidase yang sedang dinilai.

Sebagai kesimpulan, Panel berpendapat bahwa, berdasarkan kondisi penggunaan, risiko reaksi alergi setelah paparan enzim makanan ini dalam makanan tidak dapat dikesampingkan, namun kemungkinannya rendah.

3.5 Paparan makanan
3.5.1 Tujuan penggunaan enzim makanan
Enzim makanan dimaksudkan untuk digunakan dalam satu proses pembuatan makanan pada tingkat penggunaan yang direkomendasikan yang dirangkum dalam Tabel 2 .

TABEL 2. Penggunaan yang dimaksudkan dan tingkat penggunaan yang direkomendasikan dari enzim pangan sebagaimana diberikan oleh pemohon. ⁴²

a Nama tersebut telah diselaraskan oleh EFSA sesuai dengan 'Proses manufaktur pangan dan data teknis yang digunakan dalam penilaian paparan enzim pangan' (Panel CEP EFSA, 2023 ).
b Angka yang dicetak tebal menunjukkan tingkat penggunaan maksimum yang direkomendasikan, yang digunakan untuk perhitungan.

Dalam proses ini, enzim makanan ditambahkan ke wort selama fermentasi. 43 Prolil oligopeptidase menghidrolisis protein yang ada dalam wort untuk mengurangi pembentukan kabut dingin. 44 Enzim makanan–TOS tetap ada dalam bir dan produk minuman lainnya.

Berdasarkan data yang diberikan tentang termostabilitas (lihat Bagian 3.3.1 ), Panel mempertimbangkan bahwa prolil oligopeptidase ini dapat tetap dalam bentuk aktifnya selama proses pembuatan bir, tergantung pada kondisi pemrosesan.

3.5.2 Estimasi paparan makanan
Paparan kronis terhadap enzim makanan–TOS dihitung menggunakan FEIM webtool 45 dengan menggabungkan tingkat penggunaan maksimum yang direkomendasikan dengan data konsumsi individu (EFSA CEP Panel, 2021 ). Estimasi melibatkan pemilihan kategori makanan yang relevan dan penerapan faktor konversi teknis (EFSA CEP Panel, 2023 ). 46 Paparan dari semua kategori FoodEx kemudian dijumlahkan, dirata-ratakan selama total periode survei (hari) dan dinormalisasi untuk berat badan. Ini dilakukan untuk semua individu di semua survei, menghasilkan distribusi paparan rata-rata individu. Berdasarkan distribusi ini, paparan rata-rata dan persentil ke-95 dihitung per survei untuk total populasi dan per kelompok usia. Survei dengan hanya satu hari per subjek dikecualikan, dan paparan/asupan tingkat tinggi dihitung hanya untuk kelompok populasi di mana ukuran sampel cukup besar untuk memungkinkan perhitungan persentil ke-95 (EFSA, 2011 ).

Tabel 3 memberikan gambaran umum estimasi paparan yang diperoleh di seluruh survei. Paparan rata-rata dan persentil ke-95 terperinci terhadap enzim makanan–TOS per kelompok umur, negara, dan survei, serta kontribusi dari setiap kategori FoodEx terhadap total paparan makanan dilaporkan dalam Lampiran A – Tabel 1 dan 2. Untuk penilaian saat ini, data konsumsi makanan tersedia dari 48 survei makanan (mencakup bayi, balita, anak-anak, remaja, dewasa, dan lansia), yang dilakukan di 26 negara Eropa (Lampiran B ). Paparan makanan tertinggi diperkirakan sebesar 0,041 mg TOS/kg bb per hari pada orang dewasa pada persentil ke-95.

TABEL 3. Ringkasan perkiraan paparan makanan terhadap enzim makanan–TOS pada enam kelompok populasi.

3.5.3 Analisis ketidakpastian
Sesuai dengan panduan yang diberikan dalam pendapat EFSA terkait ketidakpastian dalam penilaian paparan makanan (EFSA, 2006 ), sumber ketidakpastian berikut telah dipertimbangkan dan dirangkum dalam Tabel 4 .

TABEL 4. Evaluasi kualitatif pengaruh ketidakpastian pada estimasi paparan makanan.

Singkatan: +, ketidakpastian dengan potensi menyebabkan estimasi paparan yang terlalu tinggi; –, ketidakpastian dengan potensi menyebabkan estimasi paparan yang terlalu rendah.

Pendekatan konservatif yang diterapkan untuk memperkirakan paparan terhadap enzim makanan–TOS, khususnya asumsi yang dibuat mengenai tingkat kemunculan dan penggunaan enzim makanan spesifik ini, kemungkinan besar telah menyebabkan perkiraan paparan yang berlebihan.

3.6 Margin paparan
Perbandingan NOAEL (1000 mg TOS/kg bb per hari) yang diidentifikasi dari studi tikus 90 hari dengan estimasi paparan yang diperoleh sebesar 0–0,009 mg TOS/kg bb per hari pada rata-rata dan dari 0 hingga 0,041 mg TOS/kg bb per hari pada persentil ke-95 menghasilkan margin paparan (MOE) setidaknya 24.390.

4 KESIMPULAN
Berdasarkan data yang diberikan dan margin paparan yang diperoleh, Panel menyimpulkan bahwa enzim makanan prolil oligopeptidase yang diproduksi dengan strain Trichoderma reesei DP-Nyq99 yang dimodifikasi secara genetik tidak menimbulkan masalah keamanan dalam kondisi penggunaan yang dimaksudkan.

Panel FEZ mempertimbangkan enzim pangan bebas dari sel-sel yang layak dari organisme produksi dan DNA rekombinan.

5 DOKUMENTASI SEBAGAIMANA DISEDIAKAN KEPADA EFSA
Permohonan otorisasi prolil oligopeptidase dari strain Tricoderma reesei hasil rekayasa genetika DP-Nyq99. November 2023. Diserahkan oleh Genencor international BV

Informasi tambahan. Januari 2025. Disampaikan oleh International Flavours & Fragrances Inc. atas nama Genencor International BV

Informasi tambahan. Maret 2025. Disampaikan oleh International Flavours & Fragrances Inc. atas nama Genencor International BV

SINGKATAN
■■■■■
■■■■■
APTT
waktu tromboplastin parsial teraktivasi
badan basah
berat badan
Bahasa Indonesia: CAS
Layanan Abstrak Kimia
CEP
Panel EFSA tentang Bahan Kontak Makanan, Enzim dan Alat Bantu Pengolahan
EC
Komisi Eropa
EINECS
Inventaris Eropa tentang Zat Kimia Komersial yang Ada
Uni Eropa
Uni Eropa
Organisasi Pangan dan Pertanian (FAO)
Organisasi Pangan dan Pertanian Perserikatan Bangsa-Bangsa
GLP
Praktik Laboratorium yang Baik
rekayasa genetika
organisme hasil rekayasa genetika
HCT
hematokrit
Universitas Brawijaya
Persatuan Internasional Biokimia dan Biologi Molekuler
JECFA
Komite Ahli Gabungan FAO/WHO tentang Bahan Tambahan Pangan
kDa
kilodalton
LOD
batas deteksi
MNBN
sel berinti dua dengan mikronuklei
MOE
batas paparan
Organisasi untuk Kerjasama Ekonomi dan Pembangunan (OECD)
Organisasi untuk Kerjasama Ekonomi dan Pembangunan
PCR
reaksi berantai polimerase
PEPU
Unit Endopeptidase Prolin
PT
waktu protrombin
Bahasa Indonesia: RDW
lebar distribusi sel darah merah
Persyaratan Layanan
total padatan organik
WGS
pengurutan genom secara keseluruhan
SIAPA
Organisasi Kesehatan Dunia