ABSTRAK
Peran metilasi DNA (DNAm) dan modulasinya oleh faktor makanan pada diabetes melitus gestasional (GDM) masih kurang dieksplorasi, khususnya pada populasi yang terpinggirkan. Studi ini menyelidiki perubahan DNAm pada darah tali pusat dan plasenta yang terpapar GDM dan hubungannya dengan kualitas makanan ibu dan asupan nutrisi tunggal pada populasi berpenghasilan rendah dari perbatasan Myanmar-Thailand. Desain kasus-kontrol yang cocok (GDM: n = 38, kontrol: n = 34) dipilih dari kohort kehamilan Myanmar-Thailand. Asupan makanan dinilai melalui penarikan kembali 24 jam dan dianalisis menggunakan Nutritionist Pro, dengan kualitas makanan dievaluasi oleh indeks makan sehat (HEI). DNAm diprofilkan dalam 72 darah tali pusat dan 72 sampel plasenta menggunakan array Infinium MethylationEPIC. Perbedaan signifikan dalam vitamin D makanan, total folat, dan asupan lemak jenuh diamati antara kelompok. Analisis RnBeads mengungkap hipometilasi sebagai pola DNAm yang dominan pada GDM, khususnya pada promotor ADORA2B (plasenta) dan ZFP57 (darah tali pusat). Asupan lemak jenuh yang berlebihan dikaitkan dengan profil hipometilasi GDM dan berkorelasi negatif dengan tingkat metilasi ZFP57. Studi ini menyoroti pengaruh asupan lemak jenuh pada perubahan epigenetik selama kehamilan, mengungkap biomarker potensial untuk GDM, dan menekankan perlunya intervensi nutrisi khusus populasi untuk mengurangi dampak kesehatan lintas generasi.

Singkatan
ADORA2B
reseptor adenosin A2B
ANTXR2
reseptor toksin antraks 2
Bahasa Inggris CB
darah tali pusat
DHODH
dihidroorotat dehidrogenase
DNA
Metilasi DNA
ERK1
kinase 1 yang diatur oleh sinyal ekstraseluler
GDF15
faktor pertumbuhan/diferensiasi 15
GDM
diabetes gestasional
PERGI
ontologi gen
HEI
indeks makan sehat
IQR
rentang interkuartil
NOX5
NADPH oksidase 5
KACANG
analisis pengayaan jalur
Bahasa Inggris
plasenta
SD
simpangan baku
Bahasa Inggris
lemak jenuh
Bahasa Indonesia: ZFP57
homolog protein jari seng 57
1 Pendahuluan
Diabetes melitus gestasional (GDM) adalah kelainan metabolik umum yang ditandai dengan intoleransi glukosa dan resistensi insulin kronis selama kehamilan [ 1 ]. Kondisi ini terjadi pada sekitar 14% dari semua kehamilan di seluruh dunia [ 2 ]. Namun, prevalensinya bervariasi dan bergantung pada berbagai faktor risiko dan disparitas signifikan berdasarkan etnis, usia ibu, dan status sosial ekonomi, serta aksesibilitas terhadap praktik skrining dan diagnosis [ 2 ]. Insidensinya berkorelasi positif dengan obesitas, gaya hidup sedenter, dan kejadian diabetes tipe 2 (T2D). GDM dikaitkan dengan perubahan morfologi dan fisiologis plasenta, termasuk peningkatan ukuran plasenta, ketebalan pembuluh darah, dan percabangan vili, serta gangguan transportasi glukosa dan perubahan produksi laktogen dan progesteron plasenta [ 3 ]. Sayangnya, GDM menimbulkan risiko serius bagi kesehatan ibu dan janin [ 4 ]. Untuk mendukung hipotesis Barker, anak-anak yang lahir dari ibu yang mengalami GDM selama kehamilan atau memiliki riwayat malnutrisi selama kehamilan lebih mungkin mengalami kelebihan berat badan, obesitas, dan menderita gangguan metabolisme di kemudian hari saat dewasa [ 5 ].

Selama bertahun-tahun, para peneliti telah menyoroti peran intervensi diet dalam pencegahan dan manajemen GDM [ 6 , 7 ]. Fokus mereka adalah untuk meningkatkan kesadaran mengenai pentingnya mengonsumsi makanan yang kaya nutrisi dan seimbang. Mereka mengidentifikasi beberapa pola diet seperti diet Mediterania dan diet pendekatan diet untuk menghentikan hipertensi (DASH) yang dikaitkan dengan penurunan risiko GDM [ 7 ], sedangkan makanan cepat saji dan diet Barat berhubungan positif dengan risiko GDM [ 8 ]. Ketidakamanan pangan dan akses terbatas ke makanan berkualitas tinggi telah dikaitkan dengan peningkatan risiko cacat lahir dan penyakit metabolik pada populasi berpenghasilan rendah [ 9 , 10 ]. Namun, masih ada data terbatas mengenai penilaian makronutrien tunggal, mikronutrien, dan kualitas makanan dalam kaitannya dengan GDM.

Spanou et al. [ 11 ] menggunakan metabolomik dan analisis berbasis resonansi magnetik nuklir (NMR) untuk mempelajari jalur metabolisme yang berubah yang dipengaruhi oleh GDM. Mereka mengkarakterisasi berbagai jalur yang terpengaruh seperti β-oksidasi, katabolisme asam amino rantai cabang (BCAA), metabolisme badan keton, metabolisme satu karbon, dan metabolisme asam amino aromatik [ 11 ]. Etiologi dan patofisiologi GDM bersifat kompleks dan multifaktorial, yang melibatkan predisposisi genetik, penanda inflamasi, gangguan hormonal selama kehamilan, dan status gizi ibu [ 12 ].

Baru-baru ini, beberapa penelitian menunjukkan bahwa pola DNAm di plasenta dan jaringan darah tali pusat janin dapat berubah pada GDM [ 13 , 14 ]. Namun, penelitian ini melaporkan beberapa keterbatasan dalam pekerjaan penelitian, seperti metodologi yang tidak konsisten, kontrol faktor pengganggu yang tidak memadai, dan kurangnya data klinis yang komprehensif. Selain itu, berbagai hasil yang terkadang bertentangan menunjukkan bahwa perubahan DNAm sangat bergantung pada demografi populasi dan faktor gaya hidup lainnya, seperti pola makan. Populasi ini telah diidentifikasi berisiko karena pengetahuan makanan yang buruk dan kesadaran yang terbatas tentang praktik diet yang sehat dan tepat [ 15 ]. Mengingat pertimbangan ini, penelitian kami bertujuan untuk memastikan apakah kualitas makanan ibu atau asupan nutrisi apa pun terkait dengan perubahan DNAm dalam sampel darah plasenta dan tali pusat subjek GDM dibandingkan dengan kontrol. Dengan mempelajari hubungan antara pola makan dan perubahan DNAm, faktor risiko yang dapat dimodifikasi dan epigenetika, serta biomarker makanan, dapat diidentifikasi pada GDM; ini akan membantu mengembangkan strategi untuk intervensi diet dan rekomendasi berbasis nutrisi yang dipersonalisasi untuk mengurangi hasil yang merugikan dari GDM.

2 Bahan dan Metode
2.1 Desain Penelitian
Studi kasus-kontrol yang berasal dari studi kohort observasional dan prospektif kelahiran prematur telah dilakukan. Data dikumpulkan dari September 2016 hingga Februari 2019 yang melibatkan wanita yang terdaftar selama trimester pertama kehamilan mereka. Skrining untuk GDM dilakukan antara Desember 2016 dan November 2018 (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02797327).

2.2 Populasi dan Latar Penelitian
Singkatnya, wanita dari Myanmar atau Thailand dari etnis Karen atau Burma diikuti setiap 2 minggu selama kehamilan mereka, selama persalinan, dan selama periode pascapersalinan. Studi ini merupakan bagian dari studi kohort kehamilan yang ditujukan untuk merekrut 400 wanita hamil [ 16 ]. Peserta diundang untuk penelitian ini ketika mereka memenuhi kriteria inklusi berikut: kehamilan tunggal yang layak pada trimester pertama, usia antara 18 dan 49 tahun, dan tidak ada riwayat medis atau obstetrik kritis, termasuk operasi caesar. Kriteria eksklusi dari kohort kehamilan asli mencakup perawatan darurat atau komplikasi medis atau obstetrik. GDM didefinisikan menurut kriteria Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcomes (uji coba HAPO) sebagai berikut: pengukuran glukosa darah kapiler puasa ≥ 92 mg/dL, ≥ 180 mg/dL 1 jam, atau ≥153 mg/dL 2 jam setelah konsumsi 75 g glukosa dianggap positif. Setelah memperoleh persetujuan yang diinformasikan, wanita hamil didaftarkan pada trimester pertama. Dalam kondisi seperti keguguran, kematian ibu, diagnosis T2D, kehilangan tindak lanjut, penarikan persetujuan, atau OGTT yang dilakukan terlambat atau tidak dilakukan sama sekali, subjek dikeluarkan dari penelitian. Secara total, 50 wanita mengembangkan GDM dari kelompok asli. Dari jumlah tersebut, 46 ibu yang terkena GDM dicocokkan dengan 46 subjek sehat dari kelompok yang sama, menurut kriteria pencocokan berikut: etnis; graviditas; merokok; berat badan kurang; hipertensi yang diinduksi kehamilan; preeklamsia; asma; demam; infeksi virus (seperti flu biasa, demam berdarah atau DBD, herpes, penyakit seperti influenza, dan campak); diare; malaria; antigen hepatitis positif; dan pemberian antibiotik. Mengikuti prosedur operasi standar, 38 sampel plasenta dan darah tali pusat dikumpulkan dari pasien GDM dan disimpan pada suhu −80 °C, sedangkan 34 sampel dikumpulkan dari kontrol. Setelah didiagnosis, semua pasien GDM dianjurkan untuk mengubah pola makan mereka dengan meningkatkan asupan sayur dan lentil/kacang-kacangan dan menghindari konsumsi gula, es krim, dan makanan yang digoreng. Pasien direkrut di Shoklo Malaria Research Unit (SMRU), Thailand, dan pemrosesan serta analisis sampel dilakukan oleh Sidra Medicine. Penelitian ini dilakukan sesuai dengan Deklarasi Helsinki dan disetujui oleh Komite Etik Fakultas Kedokteran Tropis, Universitas Mahidol, Bangkok, Thailand (Referensi: TMEC 15–062), Komite Etik Penelitian Tropis Oxford (referensi OxTREC: 33-15), dan komite IRB Sidra Medicine (IRB#1866255). Pengukuran klinis dan antropometrik sebelumnya dijelaskan dan dianalisis secara rinci dalam makalah penelitian sebelumnya dari tim [ 17 ].

2.3 Penilaian Diet
Data diet dikumpulkan menggunakan ingatan diet 24 jam pada empat titik waktu berbeda selama kehamilan (Trimester 1, 2, 3, dan saat melahirkan) untuk mengkorelasikan dan menyelidiki hubungannya dengan perubahan DNAm. Peserta diminta untuk memberikan ingatan terperinci dari semua makanan dan minuman yang dikonsumsi dalam 24 jam terakhir. Secara total, 37 ibu yang terkena GDM dan 31 peserta sehat memberikan ingatan diet mereka. Untuk memastikan pelaporan yang akurat, ukuran porsi diperkirakan menggunakan pengukuran rumah tangga standar, model makanan, dan alat bantu visual seperti gambar. Kemudian, rincian nutrisi dari diet dihitung menggunakan Nutritionist Pro (Axxya Inc), perangkat lunak yang menggunakan basis data besar untuk mengelola dan menganalisis data terkait nutrisi dalam pengaturan klinis, penelitian, dan pendidikan. Hidangan lokal yang awalnya tidak ditemukan di Nutritionist Pro, ditambahkan setelah pencarian resep standar yang cermat. Ukuran porsi dikonversi dalam satuan gram selama entri data di Nutritionist Pro. Nutrisi yang dihitung kemudian diunduh dari Nutritionist Pro sebagai file .xsls.

Indeks makan sehat (HEI) adalah ukuran yang dikembangkan untuk mengevaluasi seberapa dekat pola makan selaras dengan pedoman diet. Versi HEI-2015 digunakan dalam penelitian ini, yang mencerminkan pedoman diet 2015–2020 untuk orang Amerika, yang diadaptasi dengan rekomendasi diet lokal Thailand [ 18 ]. Skor HEI maksimum yang mungkin adalah 100, dengan skor yang lebih tinggi menunjukkan kepatuhan yang lebih dekat terhadap rekomendasi diet dan kualitas diet yang lebih baik. Semua subjek diberi suplemen asam folat saat pendaftaran pada trimester pertama, menurut pedoman, dengan asam folat profilaksis (5 mg per minggu, kecuali 13 wanita yang menerima 5 mg setiap hari). Tidak ada suplementasi lain yang diresepkan.

2.4 Profil Metilasi DNA Seluruh Genom
DNA genomik diekstraksi dari sampel yang dikumpulkan menggunakan QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Jerman) sesuai dengan petunjuk pabrik. Selanjutnya, DNA yang diisolasi (∼500 ng) direaksikan dengan natrium bisulfit untuk mengubah sitosin yang tidak termetilasi menjadi urasil menggunakan EZ-96 DNA methylation Kit (Zymo Research Corp., Irvine, CA, AS). DNA yang diolah dengan bisulfit mengalami amplifikasi dan fragmentasi genom secara keseluruhan, sehingga meningkatkan hibridisasi dengan Infinium MethylationEPIC BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA, AS), yang menilai lebih dari 850.000 situs CpG di seluruh genom manusia.

File data metilasi mentah (IDAT) dikumpulkan untuk analisis hilir dalam perangkat lunak R (versi: 4:3:2) ( https://www.r-project.org/ ) menggunakan paket “RnBeads”, yang merupakan metode yang kuat untuk analisis data DNAm yang komprehensif. RnBeads menawarkan berbagai fungsi berikut [ 19 ]: (i) kontrol kualitas, (ii) normalisasi dan praproses, dan (iii) analisis metilasi diferensial. Kriteria penyaringan yang ketat diterapkan untuk memprioritaskan promotor dengan metilasi diferensial rata-rata yang tinggi (Δ β ) dan representasi situs CpG yang memadai. Untuk mengukur perbedaan tingkat kelompok, kami menghitung perbedaan rata-rata-rata, yang mewakili perbedaan antara tingkat metilasi rata-rata ( nilai β ) di semua situs CpG dalam wilayah metilasi diferensial untuk GDM versus kontrol. Untuk lebih menyempurnakan kerangka statistik kami, kami melakukan uji- t tak berpasangan dengan koreksi Welch, yang memperhitungkan heteroskedastisitas yang sering diamati dalam kumpulan data biologis. Terakhir, untuk mengendalikan tingkat kesalahan berdasarkan keluarga (FWER) dan mengurangi inflasi kesalahan Tipe I, kami menerapkan metode Holm–Šídák untuk koreksi pengujian ganda.

2.5 Analisis Pengayaan Promotor Metilasi Berbeda
Kami menguji analisis pengayaan jalur (PEA) pada promotor hipometilasi di GDM menggunakan paket GOStats. Seperti yang direkomendasikan oleh tim RnBeads [ 19 ], GOStats memungkinkan kalkulasi pengayaan ontologi gen (GO) dari hasil metilasi diferensial, yang menyediakan rasio peluang pengayaan dan nilai p . Dalam konteks penelitian ini, kami dapat memeriksa pengayaan GO dari 500 promotor hipometilasi teratas yang diidentifikasi dalam plasenta dan darah tali pusat yang terpapar GDM untuk istilah ontologi proses biologis (BP) dan fungsi molekuler (MF). Untuk visualisasi dan pembuatan plot data GO, kami menggunakan SRplot (Science and Research Plot), yang merupakan alat daring dan dapat diakses bebas yang dirancang untuk memfasilitasi representasi grafis data dengan menghasilkan berbagai plot dan visualisasi [ 20 ].

2.6 Analisis Statistik
Statistik deskriptif untuk variabel diet, termasuk mean, standar deviasi, median, dan rentang, dihitung menggunakan GraphPad Prism (versi: 10.1.2) ( https://www.graphpad.com/ ) untuk mengkarakterisasi distribusi data dalam setiap kelompok. Perbedaan kualitas dan asupan diet antara kelompok dianalisis menggunakan uji- t Student atau uji Mann–Whitney U tergantung pada hasil uji normalitas. Data disajikan sebagai mean dan standar deviasi (SD) atau median dan rentang interkuartil (IQR). Koefisien korelasi Pearson dihitung untuk data yang terdistribusi normal, sedangkan koefisien korelasi peringkat Spearman digunakan untuk data yang terdistribusi tidak normal. Analisis statistik berbasis limma diintegrasikan untuk menyesuaikan kovariat seperti usia ibu atau kehamilan, jenis kelamin, dan BMI. Nilai p dikoreksi untuk beberapa pengujian menggunakan metode Holm–Šídák, dengan p < 0,05 dianggap signifikan.

3 Hasil
3.1 Perbedaan HEI dan Asupan Makanan Antara GDM dan Kontrol
Subjek penelitian dipilih dari kohort ibu dan anak setelah diagnosis GDM, seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 16 , 21 ]. Sebanyak 46 kasus GDM dicocokkan dengan 46 kontrol, yang tidak menunjukkan perbedaan dalam pengukuran demografi dan klinis (Tabel S1 ).

Kami menyelidiki kebiasaan diet keseluruhan dari wanita hamil menggunakan HEI. Analisis statistik tidak menunjukkan perbedaan signifikan dalam skor HEI antara ibu dengan GDM dan kontrol sehat (perbedaan median aktual = 0,125; uji Mann–Whitney U = 616; p = 0,7386). Namun, median skor HEI < 40 (GDM: 35,88, n = 38; kontrol: 36,00, n = 34), yang menunjukkan kualitas diet rendah pada kedua kelompok (Gambar 1A ). Kemudian, kami menyelidiki secara menyeluruh perbedaan dalam asupan nutrisi tunggal antara kasus GDM dan kontrol. Perbedaan signifikan hanya terdeteksi pada asupan lemak jenuh (SF) (g) (rata-rata ± SD: GDM 25,87 ± 19,34 g; kontrol 17,42 ± 13,27 g; p = 0,0432) (Gambar 1B ), vitamin D (IU) (rata-rata ± SD: GDM 17,45 ± 47,13 IU; kontrol 97,06 ± 111,7 IU; p = 0,0002) (Gambar 1C ), dan total folat (mcg) (rata-rata ± SD: GDM 96,75 ± 53,13 mcg; kontrol 131,7 ± 80,66 mcg; p = 0,0358) (Gambar 1D ).

3.2 Profil Hipometilasi Ditemukan pada Sampel Plasenta GDM
Pertama, analisis eksploratori dilakukan untuk memeriksa tren umum dalam DNAm yang terkait dengan GDM dalam sampel plasenta. Analisis scatterplot untuk 10.000 situs CpG paling metilasi berbeda menunjukkan profil hipometilasi yang jelas dalam kelompok GDM dibandingkan dengan kontrol (Gambar 2A ). Selain itu, profil hipometilasi yang konsisten diamati pada tingkat gen (Gambar 2B ) dan promotor (Gambar 2C ) dengan menilai 500 daerah paling metilasi berbeda. Kami kemudian melakukan analisis mendalam dengan fokus pada promotor metilasi berbeda. Kami mengidentifikasi 867 promotor metilasi berbeda dalam sampel plasenta dari kasus GDM dibandingkan dengan kontrol, yang 704 di antaranya mengalami hipometilasi dalam kelompok GDM, sedangkan 163 promotor metilasi berbeda mengalami hipometilasi dalam kelompok kontrol (Tabel S2 ). Kami menyelidiki lebih jauh analisis tersebut untuk mengidentifikasi promotor yang paling termetilasi secara diferensial menurut nilai metilasi diferensial rata-rata tertinggi (Δ β ). Setelah penyaringan menggunakan perbedaan metilasi β > 0,09 atau < −0,09 (yaitu, perbedaan metilasi 9%) dan > 10 situs CpG di wilayah tersebut, kami hanya mengidentifikasi satu promotor yang termetilasi secara diferensial yang sesuai dengan reseptor adenosin A2B (ADORA2B), yang merupakan reseptor yang digabungkan dengan protein G: (Kromosom 17, Δ β = −0,09678, p = 0,013355, jumlah situs CpG = 13) (Gambar 3A,B ). Dari 13 situs CpG yang terletak di promotor ADORA2B, yang semuanya mengalami hipometilasi dalam kelompok GDM dibandingkan dengan kelompok kontrol, kami melihat 3 teratas berdasarkan Δ β tertinggi : cg05916671 (Δ β = −0,12598), cg03729431 (Δ β = −0,1208), cg19245381 (Δ β = −0,10619) (Gambar 3C,D ).

 

3.3 Jalur yang Diperkaya dalam Promotor Hipometil Plasenta GDM
Untuk menafsirkan daftar hasil promotor metilasi berbeda dalam konteks BP dan MF, kami melakukan analisis pengayaan GO pada promotor hipometilasi dalam sampel plasenta dari kasus GDM dibandingkan dengan kontrol menggunakan paket GOstats. Berbagai jalur diperkaya ( p < 0,05), termasuk trans-splicing mRNA, melalui spliceosome (GO: 0000365, OR = 104,3), sistem renin-angiotensin otak (GO:0002035, OR = 104,30), pembungkaman gen yang dimediasi miRNA (GO:0035195, OR = 11,38), pembungkaman gen pascatranskripsi (GO:0016441, OR = 10,92), jalur pensinyalan reseptor yang digabungkan dengan protein G (GO:0007186, OR = 4,01), dan regulasi negatif proses metabolisme makromolekul (GO:0010605, OR = 1,8) (Gambar 4 , Tabel S3 ).

3.4 Profil Hipometilasi yang Sebanding Ditemukan pada Sampel Darah Tali Pusat Penderita GDM
Yang menarik, analisis scatterplot untuk mengeksplorasi pola DNAm dalam darah tali pusat mengungkapkan tren hipometilasi yang jelas pada kelompok GDM versus kontrol pada situs CpG (Gambar 5A ), gen (Gambar 5B ), dan tingkat promotor (Gambar 5C ). Analisis terfokus pada promotor yang dimetilasi secara berbeda menghasilkan identifikasi 10 promotor, dengan 7 dihipometilasi dalam kelompok GDM versus 3 yang dihipometilasi dalam kontrol (Tabel S4 ). Pendekatan serupa dari analisis mendalam diikuti dalam kasus darah tali pusat dibandingkan dengan plasenta. Setelah menerapkan kriteria penyaringan menggunakan Δ β > 0,07 atau < −0,07 dan > 10 situs CpG di wilayah tersebut, hanya homolog protein zinc finger 57 (ZFP57) yang menampilkan promotor yang termetilasi secara berbeda (Kromosom 6, Δ β = −0,079, p = 0,027663, jumlah situs CpG = 16) (Gambar 6A,B ). Menariknya, semua situs CpG dalam promotor ini mengalami hipometilasi dalam kelompok GDM dibandingkan dengan kontrol, termasuk cg08041448 (Δ β = −0,12763) dan cg19636627 (Δ β = −0,10552), yang menunjukkan Δ β tertinggi (< −0,1 atau perbedaan metilasi 10%) (Gambar 6C,D ).

 

3.5 Jalur yang Diperkaya dalam Promotor Hipometilisasi Darah Tali Pusat GDM
Selanjutnya, kami menguji pengayaan set GO pada promotor hipometilasi dalam sampel darah tali pusat dari kasus GDM dan membandingkannya dengan kontrol. Hasilnya menunjukkan bahwa beberapa jalur biologis yang diperkaya ( p < 0,05) terkait dengan regulasi kemotaksis sel endotel (GO:2001026, OR = 230,05); regulasi negatif produksi interleukin-34 (IL-34) (GO:0150159, OR = 227,07), proses metabolisme makromolekul (GO:0010605, OR = 57,49), Kinase 1 yang diatur sinyal ekstraseluler (ERK1) dan kaskade ERK2 (GO:0070373, OR = 25,86), dan respons inflamasi (GO:0050728, OR = 5,22), selain pembungkaman gen yang dimediasi miRNA dengan penghambatan translasi (GO:0010605, OR = 92,00); dan regulasi negatif perbaikan kerusakan untai ganda (GO:2000780, OR = 5,22) (Gambar 7 , Tabel S5 ).

 

3.6 “Metilasi Crosstalk” Antara Plasenta dan Darah Tali Pusat pada GDM
Meskipun masing-masing plasenta dan darah tali pusat memiliki tanda tangan DNAm genom-lebar yang unik, mungkin ada interaksi yang mendasari di mana perubahan metilasi dipengaruhi atau dibagi selama GDM. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 260 situs CpG yang termetilasi secara diferensial adalah umum, dengan variasi dalam tren metilasi antara plasenta dan darah tali pusat (Tabel S6 ). Namun, tidak ada gen atau promotor metilasi diferensial umum yang diidentifikasi. Tujuan kami berikutnya adalah untuk melihat lebih jauh ke dalam kompleksitas metilasi diferensial pada tingkat gen dan promotor dengan memeriksa apakah ada gen yang termetilasi secara diferensial yang promotornya juga termetilasi secara diferensial baik dalam plasenta maupun darah tali pusat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 87 gen termetilasi secara diferensial bersama dengan promotornya hanya dalam sampel DNA plasenta, dan untuk ini, kami melaporkan kategori gen dan tren metilasi (Tabel S7 ). Di antara daftar tersebut, kami menemukan gen dihidroorotat dehidrogenase (DHODH) (Δ β = −0,01254, p = 0,0359, jumlah situs CpG = 18) yang mengalami metilasi berbeda bersama dengan promotornya (Δ β = 0,022500884, p = 0,0283, jumlah situs CpG = 14).

3.7 Korelasi Antara Tingkat Metilasi dan Asupan Makanan
Untuk memahami sepenuhnya hubungan antara tingkat metilasi dan asupan makanan, kami melakukan analisis korelasi antara nilai β ADORA2B dan ZFP57 dan skor HEI atau salah satu zat gizi dengan asupan yang berbeda antara kedua kelompok. Korelasi negatif yang signifikan hanya terdeteksi antara nilai β promotor ZFP57 (ENSG00000204644) dan konsumsi SF ( r = -0,2625, interval kepercayaan 95% = -0,4770 hingga -0,01849, p = 0,0306) (Gambar 8A ).

Konsumsi 3,8 SF Dapat Menjelaskan Profil Hipometilasi yang Terkait dengan GDM
Untuk menyelidiki lebih lanjut hubungan antara asupan SF dan profil hipometilasi pada plasenta dan darah tali pusat, kami melakukan analisis hilir menggunakan RnBeads pada kelompok GDM khususnya dengan membagi subjeknya menjadi konsumen SF normal atau tinggi. Sesuai pedoman kesehatan Inggris dan rekomendasi diet [ 22 ], wanita disarankan untuk tidak melebihi asupan harian 20 g SF. Dengan demikian, 19 dari 37 kasus GDM diklasifikasikan sebagai konsumen SF tinggi.

Analisis eksplorasi dari scatterplot di situs CpG (Gambar 8B ) dan daerah gen dan promotor (Gambar 8C,D ) mengungkapkan profil hipometilasi dalam sampel plasenta konsumen SF tinggi dibandingkan dengan konsumen SF normal di GDM. Dengan Δβ > 0,09 atau <−0,09, hanya NADPH oksidase 5 (NOX5) yang memiliki promotor metilasi diferensial tertinggi (Kromosom 15, Δβ = −0,09099, p <0,05, jumlah situs CpG = 9) (Gambar 8D ). Namun, itu tidak terkait dengan hipometilasi promotor ADORA2B (Tabel S8 ). Asupan SF juga dikaitkan dengan profil hipometilasi dalam sampel darah tali pusat di situs CpG (Gambar 9A ) dan tingkat gen dan promotor (Gambar 9B,C ). Menariknya, reseptor toksin antraks 2 (ANTXR2) menunjukkan promotor metilasi diferensial tertinggi (Kromosom 4, Δ β = −0,08046, p < 0,05, jumlah situs CpG = 1) (Gambar 9D ), menurut Δ β > 0,08 atau < −0,8. Demikian pula, asupan SF tidak dikaitkan dengan hipometilasi ZFP57 (Tabel S9 ).

4 Diskusi
Kebiasaan diet memainkan peran penting dalam membentuk profil epigenetik, terutama selama kehamilan [ 23 ]. Dalam laporan studi konsensusnya, Komite Status Gizi dari Institute of Medicine (AS), selama kehamilan, berfokus pada pengumpulan bukti ilmiah dan menawarkan rekomendasi untuk asupan nutrisi [ 24 ]. Inisiatif ini memicu keingintahuan para ilmuwan untuk menemukan hubungan antara asupan makanan dan kondisi kesehatan dan penyakit ibu dan bayi [ 24 ]. Strategi nutrisi tertentu, seperti mengonsumsi makanan indeks glikemik rendah, meningkatkan konsumsi serat, dan menjaga asupan makronutrien yang seimbang dianggap efektif untuk mengendalikan hiperglikemia pada GDM [ 22 ]. García-García et al. [ 25 ] melakukan tinjauan sistematis yang membahas dampak pola makan sehat, kaya sayuran, buah-buahan, dan biji-bijian utuh, dalam meningkatkan metilasi DNA global.

Dalam penelitian kami, kami menyoroti profil hipometilasi dalam plasenta dan darah tali pusat dari kehamilan dengan GDM yang dapat dijelaskan oleh asupan asam lemak jenuh yang lebih tinggi selama kehamilan. Asupan SF yang berlebihan diketahui berhubungan dengan kondisi kardiovaskular dan metabolik [ 26 ]. Berdasarkan data observasi dari kelompok wanita hamil, penelitian sebelumnya memvalidasi hubungan positif dan kuat antara konsumsi SF selama kehamilan dan risiko GDM [ 27 ]. Selain itu, diet tinggi lemak ibu terbukti berhubungan dengan hipometilasi pada gen tertentu seperti tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) pada tikus C57BL/6J [ 28 ]. Sejauh pengetahuan kami, kami adalah yang pertama melaporkan perubahan DNAm yang terkait dengan konsumsi SF dalam konteks GDM, dengan fokus pada populasi yang kurang beruntung.

Dalam keadaan sehat, pola DNAm yang unik diatur dengan ketat untuk memastikan ekspresi gen, fungsi seluler, dan diferensiasi yang tepat [ 29 ]. Dengan demikian, hipometilasi dapat mengganggu keseimbangan ini dan memengaruhi perkembangan dan progresi penyakit [ 30 ], sebagaimana diduga berhubungan positif dengan patogenesis berbagai patologi, seperti kanker [ 31 ] dan gangguan neuropsikiatri atau neurodegeneratif (misalnya, penyakit Alzheimer) [ 32 ]. Namun, sedikit yang diketahui tentang hipometilasi pada gangguan metabolik, khususnya GDM.

Secara tradisional, DNAm di daerah promoter telah dikaitkan dengan pembungkaman ekspresi gen [ 33 , 34 ]. Metilasi padat pulau CpG di promoter mencegah pengikatan faktor transkripsi dan akibatnya menyebabkan terganggunya mesin transkripsi [ 34 ]. Mekanisme ini telah diterima secara luas sebagai aspek fundamental dari regulasi epigenetik. Namun, penelitian yang muncul telah menantang pandangan klasik ini, menunjukkan bahwa hubungan antara metilasi promoter dan aktivitas transkripsi lebih kompleks daripada yang diperkirakan sebelumnya [ 35 ]. Dalam kasus tertentu, metilasi promoter tidak hanya dikaitkan dengan transkripsi aktif tetapi juga dapat berkorelasi dengan peningkatan ekspresi gen [ 35 ]. Hasil penelitian yang terus berkembang ini menyoroti pentingnya mempertimbangkan identitas seluler, lingkungan, atau kondisi yang kompleks dan spesifik ketika mempelajari modifikasi epigenetik dan dampaknya pada aktivitas gen.

Promotor ADOAR2B diidentifikasi sebagai yang paling berbeda metilasinya antara GDM dan kontrol dalam sampel plasenta. Aktivasi ADORA2B diduga terlibat dalam imunitas anti-parasit melalui penghambatan pelepasan sitokin pro-inflamasi, TNFα, dan interleukin 12 (IL-12) dan stimulasi sekresi sitokin anti-inflamasi IL-10 [ 36 ]. Namun, fungsi pastinya masih kontroversial, misalnya, dalam kondisi seperti T2D, peningkatan regulasi empat hingga enam kali lipat kadar mRNA ADORA2B diamati dalam sel endotel [ 37 ]. Yang terakhir meningkatkan pensinyalan ADORA2B, yang menginduksi mediator proinflamasi, yang menyebabkan peningkatan resistensi insulin. Sebuah penelitian yang dilakukan oleh Abraham et al. [ 38 ] telah menunjukkan bahwa paparan ibu terhadap stresor lingkungan seperti polusi udara (peningkatan nitrogen dioksida sebesar 10 µg/m 3 ) selama trimester pertama dan kedua kehamilan dikaitkan dengan hipometilasi plasenta pada gen ADORA2B menggunakan Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip.

Berbagai penelitian telah memfokuskan tujuan penelitian mereka pada identifikasi mikroRNA spesifik (miRNA) sebagai prediktor GDM [ 39 , 42 ]. MiRNA adalah RNA kecil non-coding yang dapat menginduksi degradasi mRNA dan mengganggu translasinya, sehingga mengganggu ekspresi gen dan fungsi seluler [ 43 ]. Sementara temuan mereka menggembirakan, mereka masih belum memiliki kesimpulan yang jelas. Beberapa miRNA yang diidentifikasi terbukti berhubungan dengan peradangan, sekresi insulin, dan resistensi, selain angiogenesis [ 42 , 44 , 45 ]. Secara konsisten, dalam penelitian kami, kami telah memeriksa jalur biologis yang terkait dengan promotor hipometilasi dalam kelompok GDM, dan yang menarik, pembungkaman gen yang dimediasi miRNA adalah salah satu jalur yang paling diperkaya, yang juga umum antara plasenta dan darah tali pusat, sehingga lebih jauh menekankan perannya dalam GDM. Kami juga mengidentifikasi jalur umum lain yang dapat berkontribusi pada patogenesis GDM, yang merupakan regulasi negatif dari proses metabolisme makromolekul; Hal ini juga bisa sangat dipengaruhi oleh komponen makanan yang berbeda, seperti karbohidrat, lemak, dan protein [ 46 ].

Dalam penelitian kami, ZFP57 diidentifikasi sebagai yang paling termetilasi secara diferensial antara GDM dan kontrol dalam sampel DNA darah tali pusat. Hasilnya konsisten dengan laporan yang diterbitkan dari EWAS Atlas [ 47 ], yang menunjukkan bahwa sifat yang paling terkait dengan ZFP57 yang termetilasi secara diferensial adalah GDM, dengan jumlah asosiasi tertinggi (Jumlah Asosiasi = 14). Protein yang dikodekan oleh gen ini adalah protein zinc finger yang juga bertindak sebagai faktor transkripsi spesifik sel induk [ 48 ]. ZFP57 mengenali dan mengikat dinukleotida CpG termetilasi pada urutan tertentu dalam daerah kontrol pencetakan (ICR) [ 49 ]. Pengikatan ini penting untuk mempertahankan tanda metilasi selama replikasi DNA, memastikan bahwa keadaan tercetak dipertahankan sepanjang pembelahan sel dan selama embriogenesis awal [ 49 ].

Mutasi pada gen ZFP57 dapat menyebabkan hilangnya metilasi pada daerah 6q24, yang sangat penting untuk regulasi gen yang terlibat dalam produksi insulin dan metabolisme glukosa [ 50 , 51 ]. Akibatnya, mutasi ZFP57 telah dikaitkan dengan diabetes melitus neonatal sementara (TNDM) [ 51 ]. Bayi dengan TNDM biasanya mengalami retardasi pertumbuhan intrauterin, hiperglikemia, dan dehidrasi dalam beberapa minggu pertama kehidupan [ 50 ]. Kondisi ini bersifat sementara, dengan diabetes sering kali sembuh dalam beberapa bulan. Meskipun TNDM bersifat sementara, individu yang terkena berisiko mengembangkan T2D atau gangguan metabolik lainnya di kemudian hari [ 52 ]. Memahami dan memantau status metilasi ZFP57 dapat menjadi kunci dalam mendiagnosis, mengelola, dan berpotensi mencegah kondisi yang terkait dengan GDM dan penyakit metabolik lainnya.

Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa promotor hipometilasi dalam sampel darah tali pusat terlibat dalam regulasi negatif kaskade ERK1 dan ERK2. Demikian pula, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa disregulasi jalur pensinyalan ERK1/2 mungkin terkait dengan resistensi insulin secara khusus dan diabetes secara umum [ 53 , 54 ]. ERK1 dan ERK2 termasuk dalam kelompok protein yang merupakan bagian dari famili mitogen-activated protein kinase (MAPK) [ 55 ]. Kaskade ERK1/2 memainkan peran penting dalam mengatur berbagai proses seluler dan fungsi biologis, termasuk proliferasi seluler, diferensiasi, motilitas, kelangsungan hidup, dan apoptosis, serta ekspresi gen dan proses perkembangan seperti embriogenesis [ 56 ].

Perubahan metilasi pada tingkat promotor dan gen dapat mengungkapkan wawasan ke dalam mekanisme regulasi epigenetik kompleks yang menyoroti fungsi gen yang relevan dengan GDM, mekanisme patologis GDM, pengembangan biomarker, dan strategi terapi. DHODH berperan dalam jalur biosintesis pirimidin de novo, dan dalam penelitian kami, gen tersebut mengalami hipermetilasi dan promotornya mengalami hipometilasi di plasenta. Penghambatan farmakologis DHODH meningkatkan kadar faktor pertumbuhan/diferensiasi 15 (GDF15) [ 57 ]. Karena peran anti-inflamasinya dan kemampuannya untuk menginduksi produksi insulin, GDF15 dapat melindungi terhadap diabetes Tipe 1 dan Tipe 2 [ 58 , 59 ]. Jadi, perubahan metilasi pada DHODH dapat mengganggu ekspresi gen normal dan jalur perlindungan GDF15, yang dapat berkontribusi pada patogenesis GDM.

Data kami menunjukkan bahwa konsumsi SF dikaitkan dengan profil hipometilasi dominan dalam plasenta dan darah tali pusat, dan berkorelasi negatif dengan hipometilasi dalam ZFP57. Namun, promotor yang paling terhipometilasi dalam plasenta kelompok konsumen SF tinggi dalam kelompok GDM adalah milik NOX5, yang memainkan peran penting dalam mengatur kontraksi vaskular dan diketahui meningkat dalam penyakit kardiovaskular (CVD) dan nefropati diabetik [ 60 ]. Peningkatan aktivitasnya menyebabkan peningkatan produksi spesies oksigen reaktif (ROS), yang berkontribusi terhadap stres oksidatif [ 60 ]. Dalam sampel darah tali pusat, ANTXR2 menampilkan promotor yang paling terhipometilasi pada konsumen SF tinggi dalam kelompok GDM; gen ini memainkan peran penting dalam memfasilitasi interaksi seluler dengan laminin dan matriks ekstraseluler, dan peningkatan ekspresi ANTXR2 secara positif terkait dengan timbulnya diabetes tipe 1 [ 61 ]. Mengingat bahwa perempuan di negara berpendapatan rendah dan menengah (LMIC) sering memilih minyak yang lebih murah dan kurang sehat, mengidentifikasi dan terkadang mempromosikan penggunaan minyak lokal yang lebih sehat seperti minyak kedelai, minyak bunga matahari, atau minyak zaitun bisa menjadi rekomendasi diet penting untuk penanganan GDM, yang berpotensi meningkatkan hasil kesehatan ibu [ 62 ].

Hashmi et al. [ 15 ] telah menyimpulkan bahwa wanita hamil dalam populasi terpinggirkan di sepanjang perbatasan Thailand–Myanmar memiliki pengetahuan dan kesadaran terbatas tentang praktik diet yang sehat dan tepat. Di sini, kami membuktikan bahwa, untuk populasi yang sama, kualitas diet yang dinilai oleh HEI sangat rendah pada kelompok GDM dan kontrol (berkisar dari 21,75 hingga 46,33); dengan demikian, peningkatan kualitas diet dapat menjadi faktor yang dapat membantu mengurangi perbedaan pola DNAm antara kedua kelompok. Faktor potensial lain yang memengaruhi GDM termasuk aktivitas fisik, predisposisi genetik, faktor lingkungan, dan lingkungan intrauterin [ 63 ] yang semuanya mungkin terkait dengan perubahan DNAm.

Studi ini menerapkan pendekatan multidisiplin yang menggabungkan teknik biologi molekuler tingkat lanjut dan perangkat bioinformatika; namun, beberapa keterbatasan perlu diperhatikan. Pertama, ukuran sampel yang relatif kecil dapat membatasi ketahanan dan generalisasi hasil. Kedua, ketergantungan pada ingatan pola makan 24 jam dan pedoman Thailand sebagai pengganti, metode yang subjektif dan retrospektif. Studi yang lebih longitudinal dapat memberikan wawasan tentang bagaimana perubahan pola makan dari waktu ke waktu memengaruhi pola metilasi dan perkembangan GDM. Mengintegrasikan analisis genetik dan epigenetik dengan data pola makan dapat lebih jauh menjelaskan hubungan silang yang kompleks antara pola makan, hipometilasi DNA, dan GDM.

5 Kesimpulan
Studi kami menekankan dampak nutrisi tunggal pada profil epigenetik selama kehamilan, khususnya asupan SF yang lebih tinggi, yang dapat berkontribusi pada profil hipometilasi baik pada plasenta maupun darah tali pusat pada GDM. Metilasi yang berubah pada plasenta dapat mencerminkan perubahan pada lingkungan intrauterin yang disebabkan oleh GDM, yang dapat memiliki efek yang bertahan lama pada kesehatan anak. Perubahan metilasi pada darah tali pusat dapat memberikan wawasan tentang bagaimana GDM dan pola makan ibu dapat memengaruhi janin secara langsung. Hal ini penting untuk memahami potensi efek transgenerasional dan menunjukkan perlunya pendekatan nutrisi dan medis yang terintegrasi untuk pengobatan GDM. Yang terakhir menunjukkan biomarker epigenetik potensial untuk GDM, yang dapat menyiratkan identifikasi faktor makanan yang dapat membalikkan atau memodifikasi perubahan DNAm yang terkait dengan GDM. Pada akhirnya, temuan studi ini sangat relevan dengan populasi terpinggirkan yang mengalami kerawanan pangan dan pola makan berkualitas rendah, yang menyoroti kebutuhan mendesak untuk intervensi yang ditargetkan dan spesifik konteks. Di era gizi presisi, sangat penting untuk mengembangkan pedoman dan kebijakan diet khusus populasi yang membahas kebutuhan gizi unik kelompok rentan, seperti wanita hamil di lingkungan berpenghasilan rendah.