Abstrak
Banyak mikroorganisme fitopatogen dan patogen manusia telah meningkatkan resistensinya terhadap antibiotik dan fungisida konvensional, itulah sebabnya penelitian terbaru difokuskan pada eksplorasi strategi baru untuk pengelolaan dan pengendaliannya. Salah satu strategi ini adalah pencarian senyawa alami baru yang terdapat pada makrofungi liar yang dapat dimakan, yang dalam penelitian awal telah menunjukkan bukti memiliki sifat bioaktif dan nilai gizi tinggi, profitabilitas, dan biodegradabilitas, di antara manfaat lainnya. Penelitian saat ini ditujukan untuk menentukan aktivitas antibakteri dan antijamur dan toksisitas akut ekstrak kasar yang diperoleh dari tubuh buah jamur liar Cantharellus veraecrucis , Cantharellus violaceovinosus , dan Turbinellus floccosus . Hasil penelitian mengungkapkan bahwa ketiga spesies jamur memiliki aktivitas antibakteri, di mana spesies yang paling menonjol adalah Turbinellus floccosus , dengan MIC = 1000  μ g/mL terhadap Enterococcus faecalis , sedangkan C. violaceovinosus dan C. veraecrucis menunjukkan MIC = 62,5  μ g/mL, MBC = 250  μ g/mL, dan MIC = 250  μ g/mL terhadap Clavibacter michiganensis , masing-masing. Selain itu, Turbinellus floccosus menghambat jamur fitopatogen Acremonium strictum , dengan PIMG % = 62,20, dan juga menunjukkan PIMG % = 58,73 ( p ≤ 0,05) terhadap Colletotrichum asianum . Mengenai toksisitas, ketiga ekstrak jamur menunjukkan toksisitas sedang dalam kisaran LC 50 100–500  μ g/mL terhadap Artemia salina . Studi ini memberikan perkiraan pertama terhadap potensi penggunaan farmasi dan/atau pertanian dari ekstrak jamur liar yang dapat dimakan ini. Hasil yang diperoleh membuka kemungkinan pengujian ekstrak ini pada model tanaman ( in vivo ), berkontribusi pada pengembangan pestisida biodegradable masa depan yang berasal dari alam.

1. Pendahuluan
Dalam beberapa dekade terakhir, penggunaan agen antimikroba yang berbeda secara berlebihan dan/atau tidak tepat, serta faktor sosial dan ekonomi, telah menyebabkan populasi berbagai mikroorganisme menjadi semakin resistan terhadap zat tersebut. Meskipun ini adalah fenomena alami, prosesnya telah dipercepat oleh penggunaan antibiotik yang berlebihan untuk mengobati kondisi medis manusia, serta oleh penggunaannya yang meluas dalam industri peternakan dan pertanian [ 1 – 3 ]. Oleh karena itu, tidak mengherankan bahwa Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) telah mengakui resistensi multiobat sebagai ancaman utama bagi kesehatan masyarakat dan menjadi perhatian global [ 2 , 3 ]. Saat ini, 700.000 orang meninggal setiap tahun karena resistensi antimikroba, dan diperkirakan jumlah ini akan meningkat menjadi 10 juta pada tahun 2050, terutama karena beberapa bakteri patogen manusia [ 1 ]. Selain itu, ada juga kebutuhan untuk menemukan agen antijamur yang baru dan efektif terhadap ragi oportunistik patogen manusia [ 4 , 5 ]. Bakteri dan jamur fitopatogen menyebabkan kerusakan yang sangat parah pada berbagai tanaman pangan dan menghasilkan kerugian ekonomi yang signifikan sebelum dan sesudah panen. Kedua jenis organisme tersebut merupakan ancaman terhadap keberlanjutan produksi pangan global, yang menyebabkan kerugian lebih dari satu miliar dolar setiap tahun di seluruh dunia [ 6 – 9 ]. Di antara bakteri yang menyebabkan penyakit pada hampir semua tanaman pangan adalah Clavibacter michiganensis , Erwinia amylovora , Pseudomonas syringae , Ralstonia solanacearum , Xanthomonas campestris , dan Xylella [ 6 , 10 , 11 ]. Oleh karena itu, cukup beralasan untuk mencatat adanya kondisi yang sesuai untuk munculnya bakteri “superfitopatogen”, seperti bakteri super yang resistan terhadap banyak obat [ 6 ], serta munculnya jamur fitopatogen yang lebih banyak dan lebih sering, terutama genus Fusarium , Alternaria , Fusicladium , Neoerysiphe , Mycosphaerella , Trichoderma , dan Epicoccum , antara lain [ 12 ].

Saat ini, penelitian telah difokuskan pada eksplorasi strategi untuk manajemen dan pengendalian mikroorganisme patogen dan fitopatogen manusia dengan tujuan melindungi kesehatan manusia dan lingkungan [ 7 , 13 ]. Salah satu strategi ini adalah pencarian dan penemuan senyawa bioaktif baru yang terdapat pada makrofungi liar, yang telah terbukti memiliki beragam sifat bioaktif, serta nilai gizi dan keuntungan yang tinggi, di antara karakteristik lainnya. Dengan demikian, makrofungi liar dapat digunakan sebagai organisme alternatif untuk pengembangan obat, makanan fungsional, dan suplemen untuk memerangi dan mencegah penyakit manusia [ 13 – 17 ]. Berbagai macam molekul bioaktif telah dilaporkan dalam makrofungi liar yang dapat dimakan; beberapa contohnya adalah polisakarida ( β -glukan dan lentinan) dengan aktivitas imunomodulator, antitumor, dan antibakteri; asam lemak tak jenuh (oleat dan linoleat) dengan sifat antiinflamasi dan antioksidan; protein (lektin) dengan efek antijamur, imunomodulator, dan antiproliferatif; sterol (ergosterol) sebagai prekursor vitamin D; triterpen (asam ganoderik) dengan aktivitas antiproliferatif dan antibakteri; fenol (flavonoid dan asam fenolik) dengan aktivitas antioksidan dan antibakteri; dan metabolit lain seperti strobilurin dengan aktivitas antijamur [ 15 – 18 ]. Banyak jamur yang dapat dimakan dan jamur obat telah dipelajari untuk bioaktivitasnya, dimana genus yang paling umum dengan sifat antimikroba meliputi Cordyceps , Dictyophora , Ganoderma , Lentinus , Pleurotus , dan Tremella [ 17 , 18 ].

Masih terdapat kesenjangan yang harus diatasi dalam pengetahuan terkini tentang bioaktivitas banyak jamur yang dapat dimakan. Spesies dari genus Cantharellus dan Turbinellus , yang termasuk dalam kelompok jamur ektomikoriza liar, berasosiasi dengan pohon asli dan menghasilkan manfaat ekologis di hutan tropis dan sedang di Meksiko timur. Selain itu, tubuh buahnya, yang dipanen untuk dikonsumsi dan dijual selama musim hujan, sangat didambakan dan memiliki nilai ekonomi tinggi [ 19–21 ] . Spesies seperti Cantharellus cibarius , Cantharellus roseocanus , Cantharellus veraecrucis , Cantharellus violaceovinosus , dan Turbinellus floccosus telah menarik perhatian para peneliti dari berbagai bidang seperti taksonomi, ekologi, dan nutrisi [ 19–24 ] . Namun, potensinya sebagai sumber komponen nutraseutika dan bioaktif dengan aplikasi farmakologis masih dalam penyelidikan [ 22–24 ] . Oleh karena itu, mereka merupakan organisme studi yang sangat baik karena kelimpahan dan distribusinya di hutan ek dan pinus. Dengan mempertimbangkan hal di atas, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi aktivitas antibakteri, antijamur, dan toksisitas akut dari ekstrak kasar C. veraecrucis , C. violaceovinosus , dan Turbinellus floccosus melalui uji in vitro .

2. Bahan dan Metode
2.1. Bahan Biologis
Basidiom segar C. veraecrucis dan C. violaceovinosus dikumpulkan selama Juni–Oktober 2021 di hutan ek di wilayah kotamadya Zentla (837–850 mdpl), sementara basidiom Turbinellus floccosus dikumpulkan di hutan Pinus di Taman Nasional Cofre de Perote (3000–3500 mdpl), keduanya terletak di wilayah tengah Negara Bagian Veracruz, Meksiko. Basidiom dikumpulkan mengikuti protokol pengambilan sampel oportunistik [ 25 ] dan kemudian dibekukan dan dikeringkan dalam kondisi beku (LABCONCO, Kansas City, Amerika Serikat).

2.2. Ekstrak Jamur
Sampel kering (70 g) dari setiap jamur yang dapat dimakan dimaserasi secara terpisah menggunakan campuran kloroform–metanol (1 : 1  v / v ) untuk meningkatkan ekstraksi senyawa polar dan nonpolar [ 26 , 27 ]. Sampel disimpan dalam bak ultrasonik (Elmasonic S50R, Singen, Jerman) selama 60 menit, dengan frekuensi 40 kHz. Selanjutnya, biomassa dipisahkan dengan penyaringan vakum, dan pelarut kemudian diuapkan dalam evaporator putar pada suhu 40°C (Büchi R-100, Flawil, Swiss) [ 28 ]. Akhirnya, ekstrak kasar disentrifugasi pada 3260 ×  g selama 10 menit, dan supernatan yang dihasilkan disaring menggunakan  filter PTFE Econofilter 25/0,45 μ m (Agilent Technologies, Jerman). Sentrifugasi dan filtrasi yang diterapkan dalam penelitian ini meningkatkan kemurnian ekstrak, yang disimpan dalam botol pada suhu 4°C.

2.3. Organisme Patogen dan Kondisi Kultur
Dalam kasus strain bakteri yang penting secara medis, bakteri Gram-positif Enterococcus faecalis (ATCC 29212) dan Staphylococcus aureus (ATCC 25923) dan bakteri Gram-negatif Escherichia coli (ATCC 35218) disebarkan pada agar Müeller–Hinton (MCD LAB, Oaxaca, Meksiko) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ° C ± 2 ° C. Dalam kasus strain bakteri fitopatogen, bakteri Gram-positif Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (ID/46) dan bakteri Gram-negatif Erwinia persicina (h-5), Pseudomonas syringae (ID/17), Rhizobium radiobacter (ID/70), dan Xanthomonas campestris (ID/138) disediakan oleh Laboratorium Bakteriologi dari Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) dan Pabrik Percontohan untuk Pengembangan Agen Pengendalian Hayati dari Instituto de Ecología, AC Bakteri diinkubasi pada lempeng agar Müeller–Hinton selama 48 jam pada suhu 25 ° C ± 2 ° C. Koloni kedua kelompok bakteri disuspensikan kembali dalam kaldu Müeller–Hinton (Difco, Sparks, Maryland, Amerika Serikat) hingga memperoleh konsentrasi 1,5 × 105 CFU  /mL [ 29 ].

Ragi yang menarik secara klinis Candida tropicalis (CECT 1440), diperoleh dari Spanish Type Culture Collection (CECT), disebarkan pada Potato Dextrose Agar (PDA) (MCD LAB, Oaxaca, Meksiko) dan diinkubasi selama 48 jam pada 35 ° C ± 2 ° C. Koloni ragi disuspensikan kembali dalam Potato Dextrose Broth (PDB) (Condalab, Madrid, Spanyol) hingga mencapai konsentrasi 1,5 × 10 4  CFU/mL [ 5 , 30 ]. Jamur fitopatogen Acremonium strictum (CBF-230), Colletotrichum asianum (CBF-338), dan Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (CBF-338) disediakan oleh Pabrik Percontohan untuk Pengembangan Agen Pengendalian Hayati, Instituto de Ecología, AC Jamur fitopatogen disebarkan pada media PDA dan diinkubasi selama 8 hari pada suhu 25 ° C ± 2 ° C sebelum evaluasi untuk memperoleh miselium yang tumbuh aktif.

2.4. Evaluasi Antibakteri
Aktivitas antibakteri dievaluasi mengikuti pedoman Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (protokol M7-A9) [ 29 ], berdasarkan metode mikrodilusi kaldu, dengan adaptasi untuk mengevaluasi ekstrak menurut Serrano-Márquez et al. [ 28 ], Zengin et al. [ 31 ], dan Wong dan Ramli [ 32 ]. Konsentrasi hambat minimum (MIC) ekstrak kasar terhadap strain bakteri yang penting secara medis dan bakteri fitopatogen ditentukan. Metode mikrodilusi kaldu memungkinkan untuk memperoleh hasil kuantitatif (MIC) dan menentukan apakah ekstrak bersifat bakteriostatik atau bakterisida [ 29 , 32 ]. Pada pelat sumur dalam, pengenceran serial setiap ekstrak dibuat menggunakan kaldu Müeller–Hinton hingga  diperoleh konsentrasi 2000–62,5 μ g/mL. Selanjutnya, dalam mikroplat polistirena steril dengan dasar bundar 96-sumur (Costar, Kennebunk, Maine, Amerika Serikat), 75  μ L dari setiap konsentrasi ekstrak ditambahkan dan dicampur dengan 75  μ L suspensi bakteri (1,5 × 10 5  CFU/mL) untuk memperoleh volume akhir 150  μ L per sumur dan konsentrasi akhir dari Baris A (1000  μ g/mL) hingga Baris F (31,25  μ g/mL). Sumur-sumur di Baris G digunakan sebagai kontrol negatif (kaldu Müeller–Hinton, suspensi bakteri, dan 10% DMSO) dan sumur-sumur di Baris H sebagai kontrol sterilitas (kaldu Müeller–Hinton). Ampisilin dan kloramfenikol (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Serikat) digunakan pada konsentrasi awal 1000–0,4882  μ g/mL sebagai kontrol positif [ 28 ]. Mikroplat diinkubasi tergantung pada jenis bakteri. Setelah inkubasi, 30  μ L 3% 2,3,5-trifeniltetrazolium klorida (TTC) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Serikat) ditambahkan ke setiap sumur [ 31 ]. Konsentrasi terendah ekstrak yang tetap tidak berwarna dan tidak menunjukkan pertumbuhan yang terlihat dicatat sebagai MIC. Evaluasi ini dilakukan dalam tiga kejadian, dengan setiap ekstrak dievaluasi dalam rangkap tiga di setiap kejadian. Konsentrasi bakterisida minimum (MBC) ditentukan dalam ekstrak bioaktif yang memiliki MIC ≤ 1000  μ g/mL. Untuk ini, 1  μ L diambil dari setiap sumur dan disebarkan pada pelat dengan agar Müeller–Hinton, yang kemudian diinkubasi. Setelah inkubasi, konsentrasi terendah yang tersisa tanpa pertumbuhan CFU sesuai dengan MBC [ 32 ].

2.5. Evaluasi Anti-Ragi
Aktivitas antiragi dievaluasi mengikuti protokol M27-A2 dari pedoman CLSI [ 30 ], menggunakan metode mikrodilusi kaldu dengan adaptasi untuk mengevaluasi ekstrak, seperti yang dilaporkan oleh Yu et al. [ 5 ], Wong dan Ramli [ 32 ], dan Morales et al. [ 33 ]. MIC dan konsentrasi fungisida minimum (MFC) dari ekstrak kasar ditentukan terhadap Candida tropicalis . Pengujian ini mirip dengan pengujian antibakteri, tetapi pengenceran konsentrasi ekstrak (2000–62,5  μ g/mL) dilakukan dalam PDB [ 5 ]. Dalam mikroplat, 75  μ L dari setiap konsentrasi ekstrak dicampur dengan 75  μ L suspensi ragi (1,5 × 10 4  CFU/mL) untuk memperoleh volume akhir 150  μ L per sumur dan konsentrasi akhir dari Baris A (1000  μ g/mL) hingga Baris F (31,25  μ g/mL). Kontrol negatif (PDB, suspensi jamur, dan 1% DMSO) dan kontrol sterilitas (PDB) juga disertakan. Ketokonazol (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Serikat) digunakan pada konsentrasi awal 1000–0,0610  μ g/mL sebagai kontrol positif. Mikroplat diinkubasi dan 30  μ L TTC 3% kemudian ditambahkan [ 33 ]. Replikasi dilakukan, dan MIC dicatat seperti pada evaluasi aktivitas antibakteri. MFC ditentukan dalam ekstrak bioaktif yang memiliki MIC ≤ 1000  μ g/mL. Untuk ini, 1  μ L diambil dari setiap sumur, digoreskan ke media PDA, dan diinkubasi [ 32 ].

2.6. Evaluasi Antijamur
Aktivitas antijamur dievaluasi mengikuti metode penghambatan pertumbuhan radial miselium (teknik makanan beracun). Ini adalah teknik umum dan sensitif untuk mengevaluasi sifat antijamur ekstrak dan memungkinkan penentuan persentase penghambatan pertumbuhan miselium (PIMG%). Ekstrak jamur dievaluasi menurut metode yang dilaporkan oleh Al-Burtamani et al. [ 34 ], Kaur et al. [ 35 ], dan Ahuja et al. [ 36 ]. PIMG% ditentukan terhadap jamur fitopatogen. Untuk ini, medium PDA dan larutan stok yang disesuaikan dengan konsentrasi akhir 1000  μ g/mL (1% DMSO) dituangkan ke dalam cawan Petri (9 cm). Selanjutnya, cakram miselium (berdiameter 5 mm) dari setiap jamur diinokulasi di tengah setiap lempeng, masing-masing [ 34 , 35 ]. Media PDA digunakan sebagai kontrol negatif dan ketoconazole (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Serikat) sebagai kontrol positif. Plat diinkubasi selama 8 hari pada suhu 25 ° C ± 2 ° C, dan pertumbuhan miselium dicatat setiap 2 hari [ 36 ]. Evaluasi dilakukan dalam rangkap tiga dan hasilnya dinyatakan menurut Formula ( 1 ) [ 34 ]:

di mana IMc adalah pertumbuhan diameter rata-rata miselium kontrol dan IMt adalah pertumbuhan diameter rata-rata miselium dengan perlakuan.
2.7. Penentuan Toksisitas Akut
Toksisitas akut dievaluasi mengikuti metode yang ditetapkan oleh Meyer et al. [ 37 ] dan Nguta dan Mbaria [ 38 ], dengan modifikasi. Genus Artemia digunakan dalam bioassay ini karena memungkinkan analisis awal terkait dengan toksisitas, yang efektif dalam evaluasi toksisitas jamur divisi Basidiomycota [ 39 ]. Nauplii Artemia salina (White Mountain, Utah, Amerika Serikat) ditetaskan dengan menempatkan 50 mg kista dalam 100 mL air laut buatan (2,8% NaCl) dan 2 mg asam docosahexaenoic (DHA) (Acua Biomar, Mazatlán, Sinaloa, Meksiko) sebagai pengayaan untuk nauplii; media penetasan ini dimodifikasi dari metode asli [ 37 ]. Kista diinkubasi dengan aerasi dan pencahayaan konstan pada 27 ° C ± 2 ° C selama 24 jam. Selanjutnya, 400  μ L air laut buatan dan 10 nauplii ditempatkan per sumur dalam mikroplat 24 sumur, dan larutan stok setiap ekstrak kemudian ditambahkan, mengatur konsentrasi hingga mencapai 1000, 100, dan 10  μ g/mL [ 37 , 38 ]. Konsentrasi dievaluasi dalam rangkap tiga. Air laut buatan (0,5% DMSO) digunakan sebagai kontrol negatif, dan kalium dikromat (K2Cr2O7 ) digunakan dalam berbagai konsentrasi (1000, 100, dan 10  μ g/ mL ) sebagai kontrol positif. Mikroplat diinkubasi pada 27 ° C ± 2 ° C selama 24 jam. Setelah inkubasi, konsentrasi letal rata-rata (LC50 ) ditentukan , serta persentase mortalitas nauplii menurut Rumus ( 2 ) [ 38 ]:

2.8. Analisis Statistik
Data aktivitas antijamur ditunjukkan sebagai mean ± SD ( n = 3) dan dianalisis dengan analisis varians satu arah (ANOVA) untuk menentukan perbedaan yang signifikan secara statistik antara mean dari tiga jamur yang dapat dimakan. Perbedaan spesifik dalam PIMG% antara spesies jamur ditentukan dengan uji post hoc Tukey p ≤ 0,05 [ 36 ]. Analisis ini dilakukan dalam JMP Versi 14. Untuk menentukan LC50 , metode Probit digunakan dengan interval kepercayaan 95%. Metode Probit terdiri dari regresi linier untuk menetapkan hubungan antara konsentrasi zat beracun dan respons spesies yang diuji yang terpapar racun untuk waktu tertentu [ 37 ]. Data ini diproses dalam SPSS Versi 25.

3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Aktivitas Antibakteri dan Antiragi
Dalam evaluasi pertama, MIC, MBC, dan MFC dari ekstrak kasar ditentukan terhadap tiga spesies bakteri dan satu spesies ragi yang menarik secara klinis. Dalam pengujian ini, satu ekstrak jamur menunjukkan bioaktivitas, dan tingkat bioaktivitas ditetapkan menurut O’Donnell et al. [ 40 ], berkisar dari tidak ada bioaktivitas (MIC > 1000  μ g/mL) hingga bioaktivitas ringan (MIC 501–1000  μ g/mL), bioaktivitas sedang (MIC 126–500  μ g/mL), bioaktivitas baik (MIC 26–125  μ g/mL), bioaktivitas kuat (MIC 10–25  μ g/mL), dan bioaktivitas sangat kuat (MIC < 10  μ g/mL). Dalam kasus mikroorganisme yang menarik secara klinis (lihat Tabel 1 ), ekstrak Turbinellus floccosus menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif Enterococcus faecalis (ATCC 29212), dengan nilai MIC = 1000  μ g/mL, menunjukkan sedikit bioaktivitas [ 26 , 40 ]. Sejauh pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama aktivitas antibakteri dalam Turbinellus floccosus terhadap bakteri yang menarik secara klinis. Perlu dicatat bahwa bakteri Enterococcus faecalis adalah bagian dari mikrobiota manusia tetapi dapat menyebabkan infeksi serius pada saluran kemih, endokarditis, bakteremia, dan infeksi luka [ 22 ]. Hanya aktivitas antioksidan yang sebelumnya telah dilaporkan dalam ekstrak Turbinellus floccosus [ 23 ].

Tabel 1. Aktivitas antimikroba ekstrak tiga jamur yang dapat dimakan terhadap mikroorganisme yang menarik secara klinis.

Catatan: Nilai ekstrak yang menunjukkan bioaktivitas ditunjukkan dengan huruf tebal.
Singkatan: MBC, konsentrasi bakterisida minimum; MFC, konsentrasi fungisida minimum; MIC, konsentrasi penghambatan minimum; NA, tidak berlaku.

C. veraecrucis dan C. violaceovinosus tidak menghambat pertumbuhan bakteri yang menarik secara klinis. Namun, spesies dari genus Cantharellus dianggap sebagai makanan yang sangat dicari [ 20 ], dan mungkin spesies yang paling menonjol dari genus tersebut adalah Cantharellus cibarius [ 22 , 39 ]. Ada bukti penting tentang aktivitas antibakteri spesies ini. Misalnya, Kozarski et al. [ 22 ] melaporkan aktivitas ekstrak metanol Cantharellus cibarius terhadap Enterococcus faecalis , dengan MIC = 156  μ g/mL dan MBC = 2500  μ g/mL. Demikian pula, Kolundžić et al. [ 41 ] melaporkan bahwa ekstrak metanol Cantharellus cibarius aktif terhadap Enterococcus faecalis , dengan MIC = 125  μ g/mL. Tamrakar et al. [ 42 ] menemukan bahwa Cantharellus ferruginascens mempunyai efek penghambatan terhadap Staphylococcus aureus , dengan MIC = 100  μ g/mL. Muszyńska et al. [ 43 ] melaporkan bahwa ekstrak metanol Cantharellus cibarius mempunyai sedikit aktivitas antimikroba terhadap Staphylococcus aureus . Akan tetapi, ekstrak metanol Cantharellus tubaeformis dan Cantharellus cibarius tidak menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap Staphylococcus aureus , Escherichia coli , dan Candida albicans [ 44 , 45 ]. Dalam penelitian lain, Santoyo et al. [ 46 ] melaporkan bahwa ekstrak metanol Cantharellus cibarius tidak menunjukkan aktivitas fungisida terhadap Candida albicans , serupa dengan hasil penelitian kami, walaupun merupakan ragi yang berbeda dengan yang dievaluasi dalam penelitian kami, tetapi memiliki kepentingan klinis. Bukti yang tersedia [ 22 , 41 , 47 ] menunjukkan bahwa ekstrak jamur liar lebih aktif terhadap bakteri Gram-positif daripada bakteri Gram-negatif. Meskipun hasil kami menunjukkan sedikit bioaktivitas, namun hasil tersebut tidak cukup konsisten untuk mendukung kesimpulan ini. Perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram-positif dan Gram-negatif sebagian dapat menjelaskan perbedaan efek penghambatan ekstrak jamur liar [ 47]. Di sisi lain, sel ragi (eukariota) dan sel bakteri (prokariota) berbeda dalam beberapa aspek, yang dapat menjelaskan kurangnya bioaktivitas terhadap Candida tropicalis dalam ekstrak kami. Ragi berukuran lebih besar dan menunjukkan jenis reproduksi yang berbeda (tunas) dan struktur yang berbeda (membran sel dengan ergosterol dan dinding dengan kitin), yang dapat memberikan resistensi terhadap ekstrak ini. Agen antijamur umumnya memiliki tempat kerja di membran dan dinding jamur, terutama dalam biosintesis ergosterol, glukan, mikrotubulus, dan manoprotein [ 4 , 48 , 49 ]. Perlu dicatat bahwa pelarut untuk ekstraksi dapat memodifikasi bioaktivitas, kualitas, kuantitas, dan keamanan bioproduk yang diharapkan; pelarut yang digunakan dalam penelitian ini (campuran kloroform-metanol) dapat melarutkan senyawa polar dan nonpolar [ 18 , 26 , 27 , 50 ]. Efektivitas pelarut yang berbeda terkait dengan sifat kimia dan kelarutan senyawa bioaktif yang ada dalam makrofungi. Oleh karena itu, pilihan pelarut sangat penting untuk mengekstraksi senyawa tersebut dalam jumlah yang lebih tinggi atau lebih rendah, yang berpotensi mengubah hasil yang diharapkan. Aktivitas antimikroba telah dilaporkan dalam ekstrak dengan berbagai polaritas yang diperoleh terutama dengan etanol, metanol, air, etil asetat, dan kloroform [ 50 ].

Dalam kasus bakteri fitopatogen, ekstrak dari tiga jamur yang dapat dimakan menunjukkan penghambatan terhadap setidaknya satu spesies (lihat Tabel 2 ). Hasil yang paling menonjol diamati dengan ekstrak C. violaceovinosus , yang menghambat pertumbuhan Clavibacter michiganensis (ID/46) dengan bioaktivitas yang baik (MIC = 62,5  μ g/mL dan MBC = 250  μ g/mL) dan juga cukup bioaktif (MIC = 500  μ g/mL) terhadap Pseudomonas syringae (ID/17). Hasil ini konsisten dengan yang dilaporkan oleh Cieniecka-Rosłonkiewicz et al. [ 51 ], di mana ekstrak Cantharellus cibarius lebih aktif terhadap bakteri fitopatogen daripada terhadap bakteri patogen manusia.

Tabel 2. Aktivitas antibakteri ekstrak tiga jamur yang dapat dimakan terhadap bakteri yang penting bagi pertanian.

Catatan: Nilai ekstrak yang menunjukkan bioaktivitas ditunjukkan dengan huruf tebal.
Singkatan: MBC, konsentrasi bakterisida minimum; MIC, konsentrasi penghambatan minimum; NA, tidak berlaku.

Hasil penghambatan bakteri Gram-positif Clavibacter michiganensis juga konsisten dengan yang dilaporkan oleh Espinosa-García et al. [ 52 ], di mana ekstrak kloroform-metanol dari berbagai strain genus Ganoderma aktif (MIC = 31,5–1000  μ g/mL) terhadap spesies bakteri fitopatogen yang bertanggung jawab atas kanker tomat. Namun, kami memperoleh hasil yang berbeda dalam kasus ekstrak dari dua spesies Cantharellus , karena ini aktif terhadap Pseudomonas syringae (ID/17) dan ekstrak strain Ganoderma tidak [ 52 ]. Namun, ekstrak kloroform dan etanol dari Cantharellus cibarius telah menunjukkan penghambatan terhadap bakteri Gram-negatif Xanthomonas campestris , tetapi mereka dievaluasi dengan metode difusi cakram [ 53 ].

Dalam uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri fitopatogen dan bakteri yang menarik secara klinis (Gram positif dan Gram negatif), kami menggunakan antibiotik ampisilin sebagai kontrol positif, yang mekanisme kerjanya menghambat sintesis dinding sel, dan kloramfenikol, yang menghambat sintesis protein. Sebagai perbandingan, kami dapat berasumsi bahwa ekstrak bioaktif kami memiliki mekanisme kerja yang sama dan spektrum aktivitas pendek-menengah, karena mereka menghambat pertumbuhan kedua jenis bakteri yang dievaluasi [ 1 , 3 ]. Kami juga dapat mengonfirmasi bahwa perbedaan aktivitas antimikroba yang diamati antara penelitian kami dan hasil sebelumnya yang dilaporkan oleh beberapa penulis untuk spesies dari genus yang sama sebagian besar disebabkan oleh asal jamur liar, pelarut ekstraksi, metode evaluasi, konsentrasi, dan strain bakteri [ 50 , 54 ].

3.2. Aktivitas Antijamur
Potensi antijamur dari ekstrak kasar dari tiga spesies jamur yang dapat dimakan yang dipelajari dievaluasi pada konsentrasi 1000  μ g/mL [ 35 ] terhadap tiga jamur fitopatogen. Pertumbuhan diameter miselium dicatat setiap 2 hari dan PIMG(%) ditentukan. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 3 dan Gambar 1. Hasil yang paling menonjol diperoleh dengan ekstrak Turbinellus floccosus , yang menghambat dua dari tiga strain jamur fitopatogen, dengan persentase lebih besar dari 50%. Ini menunjukkan PIMG % = 62,20 ( p ≤ 0,05) terhadap spesies Acremonium strictum (CBF-230), di mana nilai p ≤ 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dibandingkan dengan ekstrak dari dua jamur yang dapat dimakan lainnya yang dievaluasi. Hal ini juga menunjukkan PIMG % = 58,73 ( p ≤ 0,05) terhadap Colletotrichum asianum (CBF-338) dan PIMG % = 30,09 terhadap Fusarium oxysporum .

Tabel 3. Aktivitas antijamur ekstrak tiga jamur yang dapat dimakan terhadap jamur yang penting bagi pertanian.

Catatan: Diameter miselium (rata-rata ± SD); PIMG%, persentase penghambatan pertumbuhan miselium; Nilai PIMG% yang diikuti oleh huruf yang berbeda secara signifikan berbeda pada p ≤ 0,05 (ANOVA, uji Tukey).
Singkatan: ND, tidak terdeteksi.

Hasil yang diperoleh dalam evaluasi ini memberikan wawasan baru tentang efek ekstrak jamur yang dapat dimakan terhadap jamur fitopatogen. Sampai saat ini, tidak ada informasi yang tersedia tentang aktivitas antijamur dari ketiga spesies jamur yang termasuk dalam famili Cantharellaceae ini. Sedikit penelitian telah dilakukan tentang aktivitas antijamur jamur liar terhadap jamur fitopatogen. Sementara Imtiaj et al. [ 55 ] melaporkan aktivitas antijamur sebesar 41,73% terhadap Colletotrichum gloeosporioides menggunakan ekstrak Stereum ostrea , ekstrak dari Turbinellus floccosus yang digunakan dalam penelitian kami menunjukkan persentase penghambatan yang lebih tinggi terhadap dua strain jamur fitopatogen. Demikian pula, Owaid et al. [ 56 ] menyelidiki aktivitas antijamur Pleurotus spp. terhadap Trichoderma harzianum dan Verticillium sp. dan memperoleh PIMG % = 11,60 dan 12,33, berturut-turut. Persentase penghambatan ini lebih rendah daripada yang diperoleh dalam penelitian kami. Lebih jauh, Imtiaj dan Lee [ 57 ] melaporkan aktivitas beberapa jamur liar terhadap Botrytis cinerea , Colletotrichum gloeosporioides , dan Colletotrichum miyabeanus , dengan PIMG% antara 12,07 dan 81,33, yang konsisten dengan hasil kami, yang mengonfirmasi bahwa jamur liar aktif terhadap jamur fitopatogen. Jamur berfilamen dan khamir memiliki struktur seluler yang sama tetapi berbeda dalam bentuk, reproduksi, laju pertumbuhan, dan respirasi, yang dapat menjelaskan mengapa ekstrak tersebut aktif terhadap jamur berfilamen tetapi tidak terhadap khamir. Kami menggunakan ketokonazol antijamur sebagai kontrol positif, yang merupakan azol spektrum luas yang menghambat khamir dan jamur berfilamen, dan dengan demikian, ekstrak kami akan dianggap memiliki spektrum sempit, karena mereka hanya menghambat pertumbuhan jamur fitopatogen [ 4 , 48 , 49 ].

Dalam konteks pengendalian hama, kawasan hutan alam merupakan sumber potensial agen alternatif yang berasal dari biologis dan berdampak rendah terhadap lingkungan. Dengan demikian, jamur liar merupakan pilihan yang menjanjikan mengingat keanekaragaman dan kemampuan beradaptasi yang tinggi terhadap berbagai kondisi. Namun, jamur liar masih belum dieksplorasi. Strategi untuk memfasilitasi identifikasi jamur liar dengan aktivitas antimikroba dapat mempertimbangkan peran ekologisnya dan apakah jamur tersebut digunakan secara lokal. Tiga spesies jamur ektomikoriza yang dapat dimakan yang dievaluasi dalam penelitian ini merupakan prospek yang menarik untuk tujuan ini. Dua di antaranya ( C. violaceovinosus dan C. veraecrucis ) baru bagi sains [ 20 , 21 ] dan beradaptasi dengan kondisi hutan Quercus tropis di Meksiko . Hingga saat ini, hanya ada satu penelitian [ 24 ] yang telah memberikan perkiraan komposisi kimia C. violaceovinosus dan C. veraecrucis , mengidentifikasi senyawa nutraceutical yang berharga seperti fenol, asam askorbat, β- karotenoid, dan karbohidrat, yang dapat memberikan sifat bioaktif yang dapat menghambat pertumbuhan fitopatogen bakteri dan jamur. Selain itu, spesies lain, seperti Cantharellus cibarius , telah menunjukkan bioaktivitas antihipertensi, sitotoksik, antioksidan, dan antibakteri yang menjanjikan [ 22 ]. Selain itu, González-Morales et al. [ 23 ] melaporkan aktivitas antioksidan dari ekstrak spesies Turbinellus floccosus dan juga membuat identifikasi awal beberapa kelompok senyawa seperti flavonoid, saponin, tanin, kuinon, dan kumarin, yang dapat dikaitkan dengan aktivitas antibakteri dan antijamur yang ditunjukkan Turbinellus floccosus dalam penelitian kami. Jamur Basidiomycete menghasilkan ekstrak dan senyawa dengan aktivitas antibakteri dan antijamur [ 50 ], dimana beberapa contoh senyawa dengan aktivitas ganda adalah dentifragilin A, striatal D [ 58 ], dentipellin, erinacine A–C [ 59 ], griseococcin [ 60 ], dan asam mikroporenat A, D, dan E [ 61 ].

Prospek yang muncul setelah menganalisis hasil luar biasa dari aktivitas antibakteri dan antijamur dari ekstrak C. veraecrucis , C. violaceovinosus , dan Turbinellus floccosus termasuk menguji ekstrak pada tanaman yang sakit di lapangan untuk berkontribusi pada pengembangan pestisida biodegradable masa depan yang berasal dari alam . Langkah selanjutnya adalah mengisolasi atau mengidentifikasi metabolit yang bertanggung jawab atas aktivitas tersebut melalui profil metabolomik dan teknik kromatografi (HPLC, GC-MS, dan NMR), semua ini dengan tujuan berkontribusi pada bioprospeksi berkelanjutan dari sumber organisme baru untuk penggunaan berkelanjutan demi kepentingan komunitas ilmiah, populasi umum, dan produsen pertanian, yang akan menambah nilai pada jamur yang dapat dimakan yang dipelajari, meningkatkan minat terhadapnya dan mendorong konservasi habitat alami mereka.

3.3. Toksisitas Akut
Toksisitas akut dinilai berdasarkan persentase mortalitas dan LC 50 dari masing-masing tiga spesies jamur yang dapat dimakan menggunakan organisme model Artemia salina (lihat Tabel 4 ). Tingkat toksisitas ekstrak dalam pengujian ini ditetapkan menurut Nguta et al. [ 62 ], di mana LC 50 > 1000  μ g/mL menunjukkan tidak ada toksisitas, LC 50 500–1000  μ g/mL menunjukkan toksisitas lemah, LC 50 100–500  μ g/mL menunjukkan toksisitas sedang, dan LC 50 < 100  μ g/mL menunjukkan toksisitas tinggi. Ketiga ekstrak jamur menunjukkan toksisitas dalam kisaran LC 50 100–500  μ g/mL, yang menunjukkan toksisitas sedang. Ekstrak yang menunjukkan tingkat toksisitas terendah adalah ekstrak dari C. violaceovinosus dengan nilai LC50 sebesar 166,238  μ g/mL. Menurut Oyetayo et al. [ 63 ], toleransi Artemia salina terhadap ekstrak jamur pada konsentrasi di atas 100  μ g/mL menunjukkan bahwa ekstrak tersebut aman untuk digunakan.

Tabel 4. Toksisitas akut ekstrak tiga jamur yang dapat dimakan yang diuji pada A. salina .

Catatan: LC 50 (mikrogram/mililiter) berarti konsentrasi yang mematikan.
Singkatan: ND, tidak terdeteksi.

Dalam studi sebelumnya oleh Ruiz-González et al. [ 39 ], ekstrak air Cantharellus cibarius menunjukkan LC 50 > 1000  μ g/mL ketika diuji pada nauplii Artemia franciscana , yang merupakan konsentrasi yang kurang beracun daripada yang dilaporkan dalam hasil kami. Perbedaan ini kemungkinan disebabkan oleh jenis ekstraksi dan spesies Artemia yang dievaluasi. Namun, Kidukuli et al. [ 64 ] mengevaluasi ekstrak metanol dari spesies Cantharellus platyphyllus dan Cantharellus isabellinus dan memperoleh nilai LC 50 masing-masing sebesar 7,85 dan 17,35  μ g/mL, yang merupakan konsentrasi yang lebih beracun daripada yang ditunjukkan oleh dua spesies Cantharellus yang dievaluasi dalam studi kami. Dalam studi lain oleh Ugbogu et al. [ 65 ], spesies dari genus Cantharellus ditemukan sangat bergizi dan tidak beracun bagi tikus pada dosis yang diuji dan oleh karena itu dapat digunakan untuk tujuan pengobatan dan kuliner.

Perlu disebutkan bahwa, dalam pencarian obat-obatan, makanan fungsional, dan produk alami yang berkelanjutan, potensi toksisitasnya harus dipertimbangkan ketika tertelan dalam dosis tinggi atau dalam kombinasi dengan obat lain, dan dengan demikian disarankan untuk menjadikannya sasaran evaluasi toksikologi keamanan [ 66 ]. Spesies jamur tertentu dapat bersifat toksik; beberapa di antaranya mematikan jika dikonsumsi. Oleh karena itu, studi toksisitas awal diperlukan untuk memvalidasi keamanannya. Disarankan juga untuk menentukan spesies yang dapat berbahaya dan keadaan yang direkomendasikan di mana mereka harus dikonsumsi (mentah atau dimasak) [ 15 , 17 ]. Selain itu, disarankan untuk melakukan uji dengan Artemia dari tahap ekstrak kasar, yang melibatkan penggunaan campuran berbagai senyawa kimia; beberapa di antaranya mungkin berpotensi toksik [ 37 ]. Alves et al. [ 54 ] juga menyebutkan bahwa spesies jamur yang dapat dimakan yang digunakan dalam penelitian tidak boleh menyebabkan toksisitas ketika tertelan. Namun, toksisitas ekstrak dan senyawa individualnya harus dievaluasi untuk mendapatkan wawasan lebih lanjut.

4. Kesimpulan
Kesimpulannya, penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak dari C. veraecrucis , C. violaceovinosus , dan Turbinellus floccosus memiliki sifat antibakteri dan antijamur yang menjanjikan sambil menunjukkan tingkat toksisitas sedang, yang menunjukkan potensinya untuk aplikasi farmasi dan pertanian. Hasil yang diperoleh memberikan kemajuan khusus dalam studi spesies jamur liar yang dapat dimakan yang ada di daerah tropis dan subtropis di Meksiko timur. Sebelum penelitian kami, sama sekali tidak ada penelitian tentang bioaktivitas spesies jamur ini, tetapi hasil kami menunjukkan bahwa mereka bioaktif terhadap patogen manusia dan fitopatogen. Penelitian ini membuka jalan bagi penelitian masa depan di mana ekstrak jamur dievaluasi dalam bioassay in vitro lainnya dan meningkatkan kemungkinan untuk melanjutkan dengan identifikasi metabolit bioaktif yang bertanggung jawab atas bioaktivitas. Berdasarkan temuan kami, langkah selanjutnya adalah beralih ke fase eksperimen dengan menguji ekstrak atau metabolit terhadap bakteri dan jamur fitopatogen secara in vivo pada tanaman (fase lapangan).