ABSTRAK
Polusi kadmium (Cd) telah muncul sebagai ancaman yang meningkat terhadap kesehatan manusia, dengan toksisitas ginjal yang ditimbulkannya terkait erat dengan stres oksidatif dan peradangan. Dalam penelitian ini, kami mengekstrak dan menganalisis antosianin primer dari 11 buah super menggunakan UPLC-Triple-TOF/MS dan mengevaluasi kapasitas antioksidannya melalui uji DPPH, ABTS, FRAP, dan ORAC. Dengan menggunakan model cedera sel Ginjal-2 Manusia (HK-2) yang terpapar Cd, kami menyelidiki efek perlindungan ekstrak antosianin buah super. Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak ini meningkatkan viabilitas sel HK-2, meningkatkan kadar T-SOD dan GSH, dan mengurangi ROS, MDA, dan NO. Lebih jauh lagi, mereka secara signifikan mengatur stres oksidatif dan gen serta protein terkait peradangan. Selain itu, kami menjelaskan mekanisme yang digunakan antosianin ini untuk mengurangi kerusakan sel yang disebabkan Cd melalui jalur oksidatif dan peradangan klasik. Temuan ini menyoroti potensi buah-buahan kaya antosianin tertentu dalam mengurangi risiko kesehatan terkait Cd dan menyarankan aplikasi praktis untuk sifat bioaktifnya dalam meningkatkan kesehatan manusia.

1 Pendahuluan
Bahasa Indonesia: Tidak seperti buah-buahan curah yang umum dibudidayakan, buah-buahan tertentu yang ditanam dalam skala kecil di bawah kondisi iklim atau regional tertentu menunjukkan bentuk, warna, atau rasa yang unik. Buah-buahan ini sering kali mengumpulkan senyawa bioaktif tingkat tinggi, yang dapat memberikan manfaat kesehatan yang luar biasa, dan akibatnya disebut sebagai “buah super” (Ciesarova et al. 2020 ; Lima et al. 2019 ; Mulati et al. 2020 ; Nazar et al. 2023 ). Dalam beberapa tahun terakhir, meningkatnya polusi kadmium (Cd), logam berat, menimbulkan ancaman yang jauh lebih rendah terhadap kesehatan manusia. Cd memiliki aplikasi yang luas di berbagai bidang produksi manusia dan kehidupan sehari-hari, termasuk pembuatan baterai, peleburan logam, penggunaan pestisida dan pupuk. Pada saat yang sama, ia dapat terakumulasi dalam tubuh organisme dalam ekosistem darat dan laut, dan akhirnya memasuki tubuh manusia melalui rantai makanan (ZH Li et al., 2023 ; Strungaru et al., 2018 ; Strungaru et al., 2017 ; R. Wang et al., 2023 ; seperti yang ditunjukkan
Cd mudah berinteraksi dengan protein dan enzim dalam tubuh manusia, terakumulasi secara biologis pada organ-organ tertentu, dengan ginjal dan hati menjadi organ target yang paling rentan terhadap efek toksiknya (Kim et al. 2013 ; B. Wang dan Du 2013 ; Wu et al. 2012 ). Studi menunjukkan bahwa perokok yang tidak terpapar oleh pekerjaan memiliki asupan Cd harian sekitar 2–20 µg, yang secara signifikan meningkatkan beban Cd ginjal dan menyebabkan gangguan ginjal yang nyata (Y. Liu et al. 2016 ). Studi sebelumnya juga telah menunjukkan bahwa cedera ginjal yang disebabkan oleh Cd sangat terkait dengan stres oksidatif dan respons inflamasi. Cd mengganggu sistem pertahanan antioksidan ginjal dengan merusak kadar total glutathione (T-GSH) dan aktivitas enzim antioksidan, yang menyebabkan akumulasi spesies oksigen reaktif (ROS) intraseluler. Proses ini selanjutnya memicu putusnya untai DNA, denaturasi protein, peroksidasi lipid (LPO), kerusakan membran mitokondria, dan apoptosis sel (Mandel et al. 2006 ). Lebih jauh lagi, Cd menstimulasi produksi oksida nitrat (NO) yang berlebihan pada jaringan ginjal. Interaksi antara NO dan anion superoksida (O₂ •− ) menghasilkan ROS poten seperti anion peroksinitrit (ONOO − ), yang tidak hanya memperburuk LPO tetapi juga memperkuat kaskade inflamasi. Mekanisme yang saling berhubungan ini secara kolektif mengintensifkan beban stres oksidatif dan mendorong kerusakan inflamasi pada jaringan ginjal, yang pada akhirnya memperparah nefrotoksisitas yang diinduksi Cd (R. Li et al. 2011 ; J. Liu et al. 2009 ).

Dalam praktik klinis, agen kimia utama yang digunakan untuk meringankan cedera akut yang diinduksi Cd meliputi asam etilendiamintetraasetat (EDTA), dinatrium edetat, dan asam 2,3-dimerkapto-1-propanesulfonat (DMPS). Meskipun kelator ini menunjukkan kemanjuran dalam mengisolasi ion logam berat, aplikasi klinisnya dibatasi oleh efek samping toksik yang bergantung pada dosis, khususnya induksi kerusakan hati dan ginjal sekunder (Born et al. 2013 ; Bradberry dan Vale 2009 ; Huang et al. 2019 ). Akibatnya, mereka tidak cocok untuk pemberian rutin sebagai suplemen makanan karena masalah keamanan ini (Baxter dan Krenzelok 2008 ; Lubovac-Pilav et al. 2013 ; Y. Wang et al. 2020 ). Oleh karena itu, antioksidan yang bersumber dari alam dan lebih aman telah muncul sebagai kandidat yang lebih unggul untuk mencegah atau mengurangi kerusakan fisiologis yang diinduksi Cd. Dalam beberapa tahun terakhir, banyak penelitian telah difokuskan pada senyawa bioaktif yang berasal dari alam, menyelidiki potensi kemanjurannya dalam mencegah atau mengurangi toksisitas Cd pada tingkat seluler dan organisme. Misalnya, naringenin telah terbukti secara efektif melemahkan apoptosis sel KGN yang diinduksi Cd, stres oksidatif, disfungsi mitokondria, dan respons inflamasi melalui modulasi ekspresi sirtuin-1 (SIRT1) (Yuan et al. 2024 ). Evodiamine tidak hanya mengaktifkan jalur antioksidan faktor nuklir E2-related factor 2 (Nrf2)/HO-1 untuk mengurangi nefrotoksisitas yang diinduksi Cd (Song et al. 2021 ) tetapi juga memperbaiki cedera inflamasi kolon dengan mengaktifkan autophagy dan menekan perakitan inflammasome NLRP3 (Ding et al. 2020 ). Epigallocatechin gallate (EGCG) dalam teh melindungi sel MC3T3-E1 terhadap apoptosis yang diinduksi Cd dan disfungsi osteogenik melalui modulasi jalur pensinyalan PI3K/AKT/mTOR dan Nrf2/HO-1. Puerarin mengerahkan mekanisme perlindungan dalam hepatosit AML12 terhadap penghambatan autofagi yang diinduksi Cd dan aktivasi inflammasome NLRP3 melalui jalur Nrf2 (Wei et al. 2024 ). Studi saat ini menyelidiki potensi quercetin untuk melindungi terhadap defisit kognitif yang diinduksi Cd pada tikus dengan memodulasi pensinyalan hilir jalur PI3K/AKT-Nrf2/ARE di hipokampus (Yu et al. 2021 ). Studi yang ada menunjukkan bahwa senyawa polifenol adalah zat yang terjadi secara alami, yang mampu memenuhi fungsi aktif yang signifikan.

Antosianin, yang diklasifikasikan sebagai senyawa flavonoid dan subkelas fitokimia fenolik, adalah pigmen yang larut dalam air yang umum ditemukan dalam buah-buahan. Senyawa-senyawa ini memberikan efek antioksidan dan antiinflamasi yang kuat terutama melalui modulasi jalur pensinyalan termasuk NF-κB dan protein 1 terkait ECH mirip Nrf2/Kelch (Keap1). Penelitian terkini tentang pengurangan kerusakan yang diinduksi Cd oleh antosianin terutama berfokus pada perannya dalam toksisitas reproduksi. Misalnya, sianidin-3- O- glukosida (C3G) telah terbukti memperbaiki proliferasi epitel yang diinduksi Cd dalam jaringan uterus murine (Yang et al. 2022 ). Antosianin yang berasal dari Lycium ruthenicum (black goji berry) meringankan stres oksidatif yang diinduksi Cd dan toksisitas testis melalui aktivasi jalur pensinyalan Nrf2 / Keap1 (Dong et al. 2024 ). Malvidin-3- O- glukosida memperbaiki disfungsi seluler yang dimediasi Cd dalam produksi estradiol pada sel granulosa manusia (Liang et al. 2023 ).

Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami terutama berfokus pada jalur stres oksidatif dan respons inflamasi, dengan mengumpulkan 11 jenis “buah super” potensial yang kemungkinan kaya akan antosianin (termasuk blueberry [BLUB], yang lebih banyak tersedia secara komersial). Kami membandingkan potensi ekstrak antosianin dari berbagai sumber buah untuk melindungi sel Human Kidney-2 (HK-2) terhadap stres oksidatif yang disebabkan oleh Cd dan kerusakan inflamasi. Tujuannya adalah untuk menilai nilai yang dapat dimanfaatkan dari “buah super” ini dan memberikan panduan konsumsi berbasis bukti.

2 Bahan dan Metode
2.1 Bahan Buah
Sebanyak 11 jenis buah-buahan digunakan dalam penelitian ini, antara lain Aronia melanocarpa (Michx.) Eloit, Padus napaulensis , Rhodomyrtus tomentosa (Ait.) Hassk, Ribes nigrum Linn., Schisandra chinensis (Turcz.) Baill., Phinia cauliflora (Mart.) Kausel, Solanum nigrum Linn., Pyracantha Fortuneana (Maxim.) Li., Campanumoea lancifolia (Roxb.) Merr., Hippoohae rhamnoides Linn. dan Vaksinium spp. Nama-nama umum dan singkatan terkait yang digunakan dalam artikel ini adalah sebagai berikut: BLUB, black chokeberry (BLCB, Dalian, Provinsi Liaoning), blackcurrant (BLCU, Shenyang, Provinsi Liaoning), khasi cherry (KHAC, Dehong, Provinsi Yunnan), schisandra (SCHI, Changbai Mountain, Provinsi Jilin), jaboticoba (JABO, Zhangzhou, Provinsi Fujian), rose myrtle (ROSM, Qingyuan, Provinsi Guangdong), Chinese firethorn (CHIF, Bijie, Provinsi Guizhou), sea buckthorn (SEAB, Lvliang, Provinsi Shanxi), spider fruit (SPIF, Chuxiong, Provinsi Yunnan), dan black nightshade (BLAN, Shaoyang, Provinsi Hunan). Kecuali BLUB (OZblu), yang dibeli dari pasar komersial lokal, semua buah lainnya dikumpulkan dari berbagai daerah selama masa kematangannya dan diangkut ke laboratorium melalui rantai dingin setiap dua hari. Buah yang berukuran seragam dan bebas penyakit dipilih untuk difoto (seperti ditunjukkan pada Gambar 2A ) dan disimpan dalam lemari es pada suhu 4°C untuk percobaan lebih lanjut.
2.2 Ekstraksi Antosianin Buah
500 g buah segar utuh yang ditimbang dengan saksama ditambahkan dengan 2 L etanol, yang telah diasamkan dengan asam format (0,1%, v/v). Campuran tersebut dicampur secara menyeluruh dalam homogenizer dan kantong berisi es ditempatkan dalam pembersih ultrasonik untuk mencegah kenaikan suhu. Suhu diatur ke 30°C dan ekstraksi ultrasonik dilakukan pada frekuensi 35 kHz selama 0,5 jam. Untuk memastikan ekstraksi lengkap, campuran harus didiamkan selama 12 jam. Setelah ini, campuran disaring melalui kain tipis, dan kemudian melalui tiga lapis kertas saring untuk mengumpulkan larutan yang diperoleh melalui penyaringan. Filtrat dipekatkan menggunakan evaporator putar vakum (Heidolph, 80 rpm, pada 30°C selama 3–4 jam). Seluruh proses ekstraksi harus dilakukan dalam gelap untuk mencegah degradasi antosianin.

Kemudian, ekstrak pekat dilarutkan dalam 200–400 mL air suling ganda, dan dipindahkan ke beberapa tabung sentrifus 50 mL. Ekstraksi fase padat ekstrak antosianin dilakukan menggunakan kolom Sep-Pak C 18 (12 cc, dengan kapasitas muat sampel 2 g, Waters Corp., Milford, MA). Langkah-langkah spesifik yang terlibat adalah sebagai berikut: pertama, kolom dengan 1 volume bed (BV) metanol diaktifkan. Kedua, kolom dengan 2 BV air suling ganda diseimbangkan. Selanjutnya, fase air yang mengandung 0,8 BV sampel diaplikasikan, kemudian gula, asam, dan kotoran lainnya dihilangkan dengan 20 BV air suling ganda. Akhirnya, eluat metanol dikenakan konsentrasi melalui sentrifugasi vakum (Konsentrator plus, pada 30°C selama 10–12 jam) hingga mencapai konsistensi seperti bubuk. Yang terpenting, proses ini dilakukan di lingkungan gelap, dan berat ekstrak bubuk dicatat dengan cermat untuk penyimpanan selanjutnya dalam freezer bersuhu −20°C.

2.3 Deteksi dan Analisis Kuantitatif Relatif Ekstrak Antosianin
2.3.1 Persiapan Sampel
Menurut penelitian kami sebelumnya (J. Chen et al. 2022 ), kami mengkarakterisasi struktur antosianin buah menggunakan UPLC Triple TOF/MS dengan sedikit modifikasi. 0,05 g sampel ekstrak antosianin ditimbang dan dilarutkan dalam 1 mL metanol tingkat kromatografi (mengandung asam format tingkat kromatografi 5 ‰). Sampel kemudian dikenakan proses vortexing dan pengocokan, setelah itu larutan diencerkan 10 kali lipat untuk memperoleh konsentrasi 5 mg/mL. Larutan dikenakan proses sentrifugal (8000 rpm, 30 menit), dengan sentrifus diatur ke suhu 4°C terlebih dahulu untuk memastikan bahwa proses dilakukan pada suhu rendah jauh dari cahaya. Setelah disaring melalui membran mikropori (sistem organik, 0,22 µm), 150 µL diambil dan ditambahkan ke botol fase cair.

2.3.2 Deteksi UPLC-MS/MS
Sistem UPLC Waters 2695-2996 digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi ekstrak antosianin. Prosedur dan sistem yang relevan adalah sebagai berikut: kolom kromatografi cair ACQUITYUPLC HSST3 (1,8 µm, 2,1 × 150 mm) digunakan sebagai fase stasioner; fase gerak A dan fase gerak B masing-masing adalah air asam format 1% (v/v) dan asetonitril asam format 1% (v/v). Program elusi yang dioptimalkan adalah: 0/5, 15/30, 23/50, 30/95 (min/B%); volume injeksi sampel adalah 3 µL; panjang gelombang deteksi adalah 520 nm; suhu kolom adalah 50°C; laju alir adalah 0,3 m/menit. Analisis LC-MS dilakukan pada Sistem AB Triple TOF6600 plus (ABSCIEX, Framingham), dan analisis spektrometri massa dilakukan dalam mode ion positif dan negatif. Pengaturan parameter optimal adalah: mode ion positif, tegangan sumber (+5,5 kV), suhu sumber (550°C), tekanan gas atomizer 1 (udara) dan gas atomizer 2 (udara) ditetapkan pada 50 psi, tekanan gas tirai (N2) ditetapkan pada 35 psi. Selain itu, kesalahan maksimum yang diizinkan ditetapkan pada ± 5 ppm. Potensi de-clustering (DP), 80 V; energi tumbukan (CE), 10 V. Untuk mode akuisisi MS/MS, parameternya hampir sama kecuali untuk CE yang ditetapkan pada 40 ± 20 V, penundaan pelepasan ion (IRD) ditetapkan pada 67, dan lebar pelepasan ion (IRW) ditetapkan pada 25. Rentang pemindaian m/z untuk ion prekursor dan ion produk ditetapkan pada 100–1500 Da dan 50–1500 Da. Lakukan kalibrasi nomor massa yang tepat secara otomatis sebelum setiap analisis menggunakan sistem konveyor kalibrasi otomatis.

2.3.3 Identifikasi dan Analisis Kuantitatif Relatif
Data kromatografi diproses menggunakan perangkat lunak PeakView (versi 1.2, AB SCIEX, Toronto, ON, Kanada). Dengan bantuan basis data Reaxys ( https://www.reaxys.com/ ), kami membandingkan data puncak fragmentasi ion dengan penelitian sebelumnya. Kemudian, dengan menggunakan C3G sebagai standar, ekspresi antosianin lain yang teridentifikasi dalam ekuivalennya dilakukan. Delapan gradien konsentrasi disiapkan untuk standar, dengan 10 µL diekstraksi untuk analisis UPLC. Prosesnya sama dengan 2.3.2.

Pembuatan kurva standar dilakukan, dengan konsentrasi sampel standar ditetapkan sebagai sumbu x dan luas puncak kumulatif (geologi) sebagai sumbu y. Derajat pemisahan standar C3G dan hubungan liniernya efektif, dengan koefisien korelasi di atas 0,99. Kemudian kuantifikasi relatif komponen antosianin utama dalam berbagai buah dapat dihitung berdasarkan rasio bahan-cair 1:4. Untuk membandingkan zat antosianin utama dalam berbagai buah super secara lebih visual, platform daring https://www.chiplot.online/ digunakan untuk membuat peta panas, dan analisis klaster dilakukan (Ji et al. 2022 ; X. Li et al. 2023 ).

2.4 Evaluasi Kapasitas Antioksidan Kimia In Vitro
Berdasarkan makalah sebelumnya yang diterbitkan oleh kelompok penelitian kami (Y. Wang et al. 2017 ), empat eksperimen evaluasi kapasitas antioksidan kimia digunakan dalam penelitian ini, termasuk 1,1-difenil-3-trinitrofenilhidrazina (DPPH), metode daya antioksidan pereduksi ion besi (FRAP), garam diammonium 2,2-benzil-di-(3-etil-benzotiazol-6-sulfonat) (ABTS), dan metode kapasitas penyerapan radikal bebas oksigen (ORAC). Hasil dinyatakan sebagai kapasitas antioksidan mg/g DW (setara Trolox, berat kering), dengan empat kali ulangan untuk setiap sampel.

2.5 Kultur Sel HK-2 dan Pemrosesan
2.5.1 Kultur Sel dan Desain Kelompok
Sel HK-2 diinokulasi ke dalam medium DMEM-F/12 (1:1) (mengandung 10% serum fetal bovine (FBS) dan 1% penisilin-streptomisin), kemudian ditempatkan dalam inkubator kultur sel steril pada suhu 37°C dan 5% CO 2 untuk kultur monolayer guna mengamati status pertumbuhan sel. Kultur pasase dilakukan ketika sel tumbuh hingga lebih dari 80% fusi, dan suspensi sel dimasukkan ke dalam cawan 10 cm baru dengan rasio 1:3.

Desain eksperimen terdiri dari tiga kelompok. Kelompok kontrol kosong (CON, kontrol): Sel dikultur dalam medium DMEM/F12 yang ditambah dengan 10% FBS. Kelompok paparan Cd klorida (MOD, model): CdCl₂ (berat molekul 183,32) dilarutkan dalam medium DMEM/F12, diikuti dengan penyesuaian konsentrasi akhir CdCl₂ menjadi 100, 75, 60, 50, 25, dan 5 µM. Kelompok paparan Cd yang diberi ekstrak antosianin: ekstrak antosianin (50 mg/mL) dilarutkan sepenuhnya dalam dimetil sulfoksida (DMSO) tingkat sel dan diencerkan secara serial untuk menyiapkan larutan stok pada 25, 12,5, dan 5 mg/mL untuk intervensi selanjutnya.

2.5.2 Penanganan Sampel Sel
Sel HK-2 dalam fase pertumbuhan logaritmik dicerna dengan tripsin EDTA, dikumpulkan dengan sentrifugasi kecepatan rendah (1050 rpm, 5 menit), dan disuspensikan kembali dalam medium. Sel-sel disemai ke dalam pelat 96-sumur pada kepadatan 5 × 10 4 sel per sumur dan diinkubasi semalaman. Medium dibuang dan diinkubasi dengan berbagai konsentrasi CdCl 2 (konsentrasi akhir 0, 5, 25, 50, 60, 75, 100 µM) selama 18 jam. Pada saat yang sama, dikumpulkan sel-sel dari periode yang sama dan diinokulasikan ke dalam pelat 96-sumur pada kepadatan 5 × 10 4 sel per sumur. Inkubasi semalaman, buang media kultur, dan tambahkan media kultur yang mengandung ekstrak antosianin dengan konsentrasi berbeda (konsentrasi akhir 25, 62,5, 125, 250 µg/mL) selama 24 jam, dengan tiga sumur replikasi ditetapkan untuk setiap perlakuan. Dalam kasus ini, setiap sumur mengandung 200 µL sistem larutan, yaitu, 1 µL ekstrak antosianin pekat ditambahkan ke 199 µL media sel (mengandung sel yang tumbuh melekat). Penting untuk dicatat bahwa konsentrasi ekstrak setelah penambahan akan diencerkan 200 kali lipat, yang harus digunakan untuk menghitung konsentrasi akhir yang sesuai dan konsentrasi pekat ekstrak antosianin, yang akan dikonfigurasi.

Ekstrak antosianin, karena penambahan volume kecilnya ke sistem ko-inkubasi, dapat dengan cepat dan menyeluruh larut dan menyebar ke dalam media kultur sel di setiap sumur, sehingga mencapai kontak lengkap dengan sel dan mempertahankan warna media asli. Dalam percobaan, sumur dikonfigurasi tanpa ekstrak antosianin, hanya berisi media dan DMSO untuk uji kontrol, sehingga secara efektif menghindari kesalahan eksperimen yang disebabkan oleh warna antosianin.

2.5.3 Uji Proliferasi dan Toksisitas Sel
Viabilitas sel dinilai menggunakan kit deteksi proliferasi sel dan sitotoksisitas (CCK-8, Shanghai Beyotime Biotechnology Co. Ltd., Tiongkok). Setelah periode perawatan, media kultur dibuang, dan sel dicuci dua kali dengan PBS. 10 µL reagen CCK-8 diencerkan dalam media DMEM/F12 bebas serum (1:9, v:v) dan ditambahkan ke setiap sumur. Setelah inkubasi selama 1,5 jam dalam gelap pada suhu 37°C, nilai kerapatan optik pada panjang gelombang 450 dan 620 nm diukur menggunakan pembaca mikroplat. DMSO digunakan sebagai kontrol pelarut kosong. Data dianalisis untuk menghitung tingkat kelangsungan hidup sel, menggunakan rumus berikut:
Sebelum pelaksanaan percobaan formal, uji coba awal dilakukan dengan memasukkan berbagai gradien ekstrak antosianin dari 11 buah ke dalam sel selama 24 jam. Tujuan uji coba ini adalah untuk memastikan dosis aman yang tepat, yang ditentukan oleh penilaian kelangsungan hidup sel. Konsentrasi yang dipilih adalah konsentrasi di mana kelangsungan hidup sel mencapai nilai lebih dari 80%. Secara bersamaan, kami menilai dampak gradien konsentrasi Cd klorida yang berbeda pada kelangsungan hidup sel melalui inkubasi bersama dengan sel. Konsentrasi induksi Cd terendah yang sesuai dengan tingkat kelangsungan hidup sel lebih dari 60% dipilih untuk analisis lebih lanjut.

2.5.4 Pembentukan Model Kerusakan Sel HK-2 yang Diinduksi Cd
Berdasarkan hasil percobaan pendahuluan pada 2.5.3, konsentrasi pemodelan CdCl 2 dipilih sebesar 60 µM , dan konsentrasi percobaan akhir ekstrak antosianin dipilih sebesar 25 µg/mL.

Sel HK-2 dalam fase pertumbuhan logaritmik dicerna dengan tripsin-EDTA dan dikumpulkan dengan sentrifugasi kecepatan rendah (1050 rpm, 5 menit). Setelah mensuspensikan kembali pelet sel dalam media kultur, 5 × 10 4 sel per sumur disemai dalam pelat 96 sumur dan diinkubasi semalaman pada suhu 37°C dalam atmosfer 95% CO 2 agar sel dapat menempel. Sel dari ketiga kelompok eksperimen diperlakukan secara seragam dan dikultur selama 24 jam.

Kelompok kontrol terdiri dari sel-sel HK-2 yang dipelihara dalam kondisi kultur standar, dengan kelompok kontrol kosong paralel yang diobati dengan DMSO untuk memperhitungkan efek pelarut. Pada kelompok model, sel-sel HK-2 terpapar pada medium yang mengandung 60 µM CdCl₂ selama 24 jam. Untuk kelompok yang terpapar Cd yang diintervensi dengan ekstrak antosianin, sel-sel tersebut pertama-tama diinkubasi bersama dengan medium yang mengandung konsentrasi akhir 25 µg/mL ekstrak antosianin selama 6 jam. Setelah itu, medium asli dibuang dan diganti dengan medium DMEM/F12 yang mengandung konsentrasi akhir 60 µM CdCl2 . Ekstrak antosianin ditambahkan sekali lagi, membuat inkubasi bersama dilanjutkan selama 24 jam. Tiga sumur replikasi disiapkan untuk setiap perlakuan. Viabilitas sel dan indeks lainnya ditentukan menggunakan metode yang dijelaskan dalam 2.5. Seluruh percobaan dilindungi dari cahaya sebanyak mungkin.

2.5.5 Pengukuran Kandungan ROS Sitoplasma dan Pelepasan NO
Tingkat ROS dan pelepasan NO dalam larutan kultur sel diukur pada akhir perawatan sel di setiap kelompok menggunakan kit komersial (Shanghai Beyotime Biotechnology Co. Ltd., China) sesuai dengan petunjuk.

2.5.6 Deteksi Aktivitas Enzim Antioksidan Seluler dan Kandungan Malondialdehid (MDA)
Setelah perlakuan sel, baik supernatan maupun sel dikumpulkan. Pelet sel yang dikumpulkan dicuci satu hingga dua kali dengan PBS, kemudian 0,3–0,5 mL PBS ditambahkan untuk menangguhkan sel. Setelah fragmentasi ultrasonik, sel-sel tersebut diuji. Deteksi aktivitas enzim antioksidan seperti MDA dan superoksida dismutase (SOD) dalam sel dilakukan menggunakan kit reagen komersial (Nanjing Jiancheng Biotechnology Co. Ltd., China) sesuai dengan petunjuk.

2.5.7 Pengukuran Kandungan Faktor Inflamasi Seluler
Perlakuan sel sama dengan 2.5.6. Diencerkan dengan tepat dan digunakan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) untuk deteksi. Ikuti petunjuk kit ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., China) untuk langkah-langkah spesifik.

2.5.8 Deteksi PCR Kuantitatif terhadap Ekspresi Gen yang Terkait dengan Stres Oksidatif dan Peradangan
Bahasa Indonesia: Untuk mengumpulkan sel yang memadai untuk analisis ekspresi gen, sel HK-2 dikultur dalam pelat enam sumur. Setiap kelompok sel diperlakukan seperti Bagian 2.5.4 . Setelah perlakuan, supernatan dan sel dikumpulkan. Total RNA diekstraksi dari sel HK-2 sesuai dengan petunjuk yang diberikan dalam manual untuk kit ekstraksi cepat total RNA (Zhejiang Easy-Do biotechnology Co. Ltd., Tiongkok). Setelah ini, DNA dihilangkan, dan cDNA disintesis dengan transkripsi balik menggunakan kit transkripsi balik (HisScript II Q RT SuperMix untuk qPCR, Nanjing Vazyme Biotech Co. Ltd., Tiongkok). Selanjutnya, premix kuantifikasi fluoresensi berbasis pewarna (ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix, Nanjing Vazyme Biotech Co. Ltd., Tiongkok) digunakan untuk deteksi qPCR pada instrumen PCR kuantitatif fluoresensi waktu nyata CFX. Untuk setiap percobaan, enam sumur replikasi disiapkan dan percobaan diulang setidaknya tiga kali. β-aktin digunakan sebagai referensi internal, dan ekspresi gen relatif dihitung menggunakan metode 2-ΔΔCt. Urutan primer qRT-PCR ditunjukkan pada Tabel S1 dan S2 .

2.5.9 Pengolahan dan Analisis Data
Analisis statistik dilakukan menggunakan IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corp., Armonk, NY). Semua data disajikan sebagai mean ± standard error of the mean (SEM). Pelabelan alfabetis (huruf kecil) digunakan untuk secara ringkas menunjukkan subkelompok yang berbeda secara statistik ( p < 0,05) yang diidentifikasi melalui perbandingan post hoc. Semua kumpulan data diproses dan divisualisasikan menggunakan GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) dan OriginPro 2021b (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Diagram skematik dibuat dengan BioRender.com, dan komposisi gambar akhir disusun menggunakan Microsoft PowerPoint 365 (Microsoft Corporation, Redmond, WA).

3 Hasil
3.1 Identifikasi Komponen Utama Ekstrak Antosianin
Spektrometri massa resolusi tinggi digunakan untuk menganalisis komponen antosianin utama dalam blueberry dan 10 jenis buah super. Spektrum UPLC ditumpuk dan digabung pada 520 nm ke dalam Gambar 2B untuk presentasi. Sesuaikan sedikit waktu retensi berdasarkan Puncak 8 (C3G). Data spektrometri massa yang diperoleh dibandingkan dengan literatur yang diterbitkan, dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1 , termasuk waktu retensi, data rasio massa terhadap muatan (m/z), rumus molekul, dan referensi. Dari buah-buahan super ini yang menyajikan warna yang berbeda, total 27 antosianin diidentifikasi, yang mencakup enam aglikon paling umum dalam makanan nabati: sianidin (m/z 287), delphinidin (m/z 303), petunidin (m/z 317), peonidin (m/z 301), pelargonidin (m/z 271), dan malvidin (m/z 331).
Di antara 27 senyawa antosianin yang disebutkan di atas, C3G (Peak 8) dikalibrasi sesuai dengan standarnya, sedangkan 26 senyawa antosianin yang tersisa dihitung berdasarkan padanan C3G. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel S3 (nomor sumbu vertikal tabel mewakili 27 antosianin yang teridentifikasi). Kandungan relatif total antosianin dalam BLUB adalah yang tertinggi (3428 mg C3G/kg segar), diikuti oleh BLCB (2145 mg C3G/kg segar), BLCU (2104 mg C3G/kg segar), KHAC (1198 mg C3G/kg segar), dan ROSM (1108 mg C3G/kg segar). Sementara itu, melalui analisis klaster sederhana dari spesies dan kandungan antosianin utama dalam berbagai buah super, kami menemukan bahwa kelompok-kelompok ini relatif mirip: BLUB dan BLCB, BLCU dan KHAC, JABO dan ROSM. Peta panas (Gambar 2C ) diambil dari data pada Tabel S3 untuk memberikan gambaran yang lebih visual tentang kuantifikasi relatif antosianin utama dalam berbagai buah super. Semakin gelap warnanya, semakin tinggi kandungan antosianin dalam buah super tersebut. Dan analisis klaster sederhana pada Gambar 2C menunjukkan kesamaan kandungan spesies antosianin dari buah super ini, seperti BLCU dan KHAC, BLCB, dan BLUB.

Mengingat bahwa jenis dan konsentrasi antosianin bervariasi di antara buah-buahan yang berbeda, aktivitas antioksidan kimia in vitro mereka memberikan wawasan berharga ke dalam kapasitas antioksidan dari berbagai buah super. Hasilnya disajikan dalam Gambar 2D . Dalam percobaan DPPH, aktivitas antioksidan antosianin buah super menunjukkan perubahan yang signifikan antara 59,88 ± 3,88 dan 942,82 ± 36,73 µg Trolox/mg FW. Di antara mereka, BLCB memiliki nilai DPPH tertinggi, berbeda secara signifikan dari BLUB, sementara BLAN memiliki nilai DPPH terendah. Dalam percobaan FRAP, BLCB dan KHAC memiliki nilai FRAP tertinggi, dan ada perbedaan yang signifikan antara BLCB dan BLUB. BLAN masih memiliki nilai FRAP terendah. Dalam percobaan ABTS, BLCB dan KHAC memiliki nilai ABTS tertinggi, keduanya secara signifikan lebih tinggi daripada BLUB, sementara SPIF, SEAB, dan BLAN memiliki nilai ABTS terendah, tetapi perbedaannya tidak signifikan. Dalam percobaan ORAC, BLCB, KHAC, dan ROSM memiliki nilai ORAC tertinggi, semuanya secara signifikan lebih tinggi daripada BLUB, sementara SEAB dan BLAN memiliki nilai ORAC terendah, tanpa perbedaan yang signifikan. Secara keseluruhan, kapasitas antioksidan BLCB lebih tinggi daripada BLUB, dan kapasitas antioksidan BLAN adalah yang terendah.

3.2 Efek Ekstrak Antosianin terhadap Kelangsungan Hidup Sel HK-2, Produksi ROS, dan Pelepasan NO pada Paparan CdCl 2
Metode antioksidan kimia in vitro sering kali kesulitan untuk meniru lingkungan fisiologis yang kompleks dan dinamis secara akurat, dan metode tersebut tidak memperhitungkan kemampuan antioksidan untuk menembus membran sel. Akibatnya, eksperimen berbasis sel diperlukan untuk eksplorasi lebih lanjut. Sebelum menetapkan apakah antioksidan alami dapat dikembangkan menjadi makanan fungsional atau obat-obatan, penting untuk melakukan evaluasi sitotoksisitas guna menentukan rentang konsentrasi yang tepat.

Untuk mengidentifikasi konsentrasi paparan CdCl₂ yang sesuai, kami secara eksperimental menyelidiki efek paparan Cd bersama dengan antosianin dari buah super pada berbagai gradien konsentrasi. Aktivitas penghambatan ekstrak pada sel HK-2 dievaluasi seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3A,B . Ketika konsentrasi paparan Cd meningkat dari 5 menjadi 100 µM, aktivitas sel HK-2 menurun dari 96,82% ± 3,49% menjadi 7,65% ± 0,45%. Pada konsentrasi paparan Cd 60 µM, tingkat kelangsungan hidup sel HK-2 adalah 64,91% ± 9,01%. Selain itu, kami mengamati perbedaan yang signifikan dalam efek berbagai ekstrak antosianin pada tingkat kelangsungan hidup sel HK-2. Konsentrasi tinggi (250 µg/mL) ekstrak antosianin dari BLAN dan JABO mengakibatkan tingkat kelangsungan hidup sel menurun hingga sekitar 20%, yang menunjukkan toksisitas proliferatif yang nyata. Sebaliknya, pada konsentrasi yang lebih rendah (25 µg/mL), tingkat kelangsungan hidup sel HK-2 yang diobati dengan semua ekstrak antosianin buah melebihi 80%. Namun, ketika diinkubasi bersama dengan sel HK-2 normal pada konsentrasi 62,5 µg/mL, tingkat kelangsungan hidup sel yang diobati dengan BLAN, JABO, dan CHIF semuanya turun di bawah 80%, dengan CHIF menunjukkan toksisitas proliferatif yang paling signifikan pada konsentrasi ini. Oleh karena itu, dalam membangun model stres oksidatif dan respons inflamasi yang disebabkan oleh Cd pada sel HK-2, percobaan dilakukan dengan menggunakan konsentrasi paparan Cd sebesar 60 µM dan konsentrasi akhir ekstrak antosianin sebesar 25 µg/mL.

Hasil penelitian menunjukkan (Gambar 3C ) bahwa terdapat perbedaan aktivitas sel yang signifikan antara kelompok model (MOD) dan kelompok kontrol (CON) setelah paparan Cd. Ekstrak antosianin dari berbagai buah super dapat meningkatkan tingkat kelangsungan hidup sel HK-2 yang diinduksi Cd hingga tingkat yang bervariasi. BLCB memiliki efek yang lebih baik dalam meningkatkan aktivitas sel daripada BLUB, KHAC, dan BLCU, tetapi tidak ada perbedaan yang signifikan. CHIF, SEAB, SPIF, dan BLAN memiliki efek terkecil dalam meningkatkan aktivitas sel dan tidak ada perbedaan yang signifikan.

Peningkatan stres oksidatif dan akumulasi ROS adalah faktor kunci dalam kerusakan sel ginjal yang diinduksi Cd, dan tingkat ROS merupakan indikator penting kerusakan oksidatif seluler yang disebabkan oleh fungsi fisiologis normal dan faktor lingkungan. NO adalah molekul indikator inflamasi yang terlibat dalam berbagai reaksi patologis inflamasi. Dalam kondisi fisiologis normal, ROS dan NO berada pada tingkat yang relatif rendah dalam tubuh. Setelah paparan Cd, seperti yang digambarkan dalam Gambar 3D,E , sel kelompok model menghasilkan ROS yang berlebihan, dengan perbedaan yang sangat signifikan. Lebih jauh lagi, pelepasan NO juga meningkat secara substansial, menunjukkan bahwa paparan Cd dapat menyebabkan stres oksidatif yang cukup besar dan kerusakan inflamasi pada sel. Intervensi ekstrak antosianin yang berbeda dapat mengubah produksi ROS dan pelepasan NO dalam sel HK-2 di bawah paparan Cd. Di antara mereka, BLCU, BLCB, dan KHAC secara signifikan menghambat pelepasan ROS, dan semuanya lebih unggul daripada BLUB. Sementara itu, BLCB, diikuti oleh BLUB, KHAC, BLCU, ROSM, JABO, SCHI, CHIF dan SPIF, semuanya menunjukkan efek penghambatan yang signifikan terhadap pelepasan NO, tetapi SEAB dan BLAN tidak menunjukkan efek yang signifikan.

3.3 Efek Ekstrak Antosianin terhadap Kapasitas Antioksidan dan Gen Terkait Stres Oksidatif Sel HK-2 yang Terpapar CdCl 2
Efek ekstrak antosianin pada aktivitas enzim antioksidan dan kadar T-GSH dalam sel yang terpapar Cd diilustrasikan dalam Gambar 4A . Dibandingkan dengan kelompok kontrol, aktivitas beberapa enzim antioksidan dan T-GSH berkurang secara signifikan dalam sel kelompok model, dengan aktivitas SOD menunjukkan penurunan paling nyata, yang secara statistik signifikan. Khususnya, BLCB dan KHAC menunjukkan efek signifikan dalam meningkatkan aktivitas enzim CAT, menunjukkan perbedaan signifikan, dibandingkan dengan BLUB. Sementara BLCB secara signifikan memobilisasi aktivitas enzim SOD dan enzim GSH-Px, tidak ada perbedaan signifikan yang diamati jika dibandingkan dengan BLUB. Efek CHIF, SPIF, BLAN, dan SEAB pada aktivitas enzim antioksidan tidak signifikan. Dalam penilaian kadar T-GSH, efek SPIF, SEAB, dan BLAN tidak signifikan. Namun, ekstrak antosianin dari buah super lainnya menunjukkan efek positif.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa peningkatan kadar MDA pada sel HK-2 yang terpapar Cd sangat signifikan jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Setelah intervensi dengan ekstrak antosianin, efek yang berbeda diamati dalam penghambatan produksi MDA yang diinduksi Cd pada sel HK-2. Secara khusus, KHAC, BLCB, dan BLCU menunjukkan efek penghambatan yang signifikan, dengan KHAC dan BLCB menunjukkan perbedaan yang signifikan, dibandingkan dengan BLUB. ROSM juga menunjukkan efek yang nyata, sementara dampak dari buah super lainnya tidak signifikan secara statistik.

Sementara itu, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4B , efek ekstrak antosianin pada ekspresi gen terkait stres oksidatif—termasuk yang terkait dengan enzim antioksidan dan faktor kunci dalam jalur antioksidan klasik—diselidiki dalam sel HK-2 yang terpapar Cd. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kelompok model menunjukkan pengurangan yang signifikan dalam ekspresi gen terkait enzim antioksidan ( Sod1, Cat, Gpx1, Gss ). Ekstrak antosianin memiliki efek yang berbeda pada ekspresi gen terkait enzim antioksidan. Di antara mereka, JABO dapat secara signifikan meningkatkan ekspresi gen Cat dan Sod1 , dan efek regulasinya pada gen Cat secara signifikan berbeda dari BLUB. Dalam hal peningkatan ekspresi gen Sod1 , KHAC, BLCB, ROSM, BLCU, dan CHIF juga memiliki efek yang signifikan. BLCB, KHAC, dan ROSM secara signifikan meningkatkan ekspresi gen Gpx1 , sementara KHAC memiliki efek signifikan terhadap ekspresi gen Gss , tetapi BLUB tidak memiliki efek regulasi signifikan pada gen Gpx1 dan Gss .

Jalur pensinyalan Nrf2/Keap1 berperan penting dalam respons seluler terhadap stres oksidatif (C. Chen et al. 2023 ). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, paparan Cd mengakibatkan penurunan signifikan ekspresi gen Nrf2 pada sel HK-2, disertai peningkatan signifikan ekspresi Keap1 dan Cul3. .

Sebaliknya, sel yang diobati dengan ekstrak antosianin dari buah super menunjukkan peningkatan ekspresi gen Nrf2 dan penurunan ekspresi gen Keap1 dan Cul3 , dibandingkan dengan kelompok model. Khususnya, JABO, BLCB, dan KHAC secara signifikan meningkatkan tingkat ekspresi gen Nrf2 , meskipun tidak ada perbedaan yang signifikan, dibandingkan dengan BLUB. Sebaliknya, CHIF, SPIF, SEAB, dan BLAN tidak memiliki efek signifikan pada ekspresi Nrf2 . Selain itu, SEAB tidak berdampak signifikan terhadap penurunan ekspresi gen Keap1 , dan BLAN, CHIF, dan SEAB juga tidak menunjukkan efek signifikan terhadap penurunan ekspresi gen Cul3 .

Secara keseluruhan, BLCB dan BLUB memiliki efek regulasi yang signifikan pada enzim antioksidan dan peroksida dan juga memiliki efek signifikan pada tiga gen kunci dalam jalur klasik antioksidan Nrf2/Keap1/Cul3 . Namun, BLUB tidak menunjukkan efek regulasi yang signifikan pada ekspresi gen Cat , Gpx1 , dan Gss . Sebaliknya, JABO dan KHAC menunjukkan kemampuan regulasi khusus dalam hal ini.

3.4 Efek Regulasi Ekstrak Antosianin terhadap Sitokin Inflamasi dan Gen Terkait Inflamasi pada Sel HK-2 yang Terpapar CdCl 2
Stres oksidatif yang konstan dapat menyebabkan peradangan dan kerusakan pada tubuh. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5 , kami menyelidiki efek ekstrak antosianin pada sekresi faktor inflamasi dan ekspresi gen terkait dalam sel HK-2 yang terpapar Cd. Ini termasuk sitokin proinflamasi IL-6, IL-1β, TNF-α, protein terkait jalur pensinyalan stres inflamasi Jak2/Stat3 JAK2 dan STAT3, dan protein reseptor inflammasome NLRP3.
Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kelompok model secara signifikan meningkatkan ekspresi faktor dan protein terkait inflamasi karena induksi Cd. Setelah intervensi dengan ekstrak antosianin, ekspresi faktor inflamasi dan protein dalam sel juga dihambat hingga derajat yang bervariasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa BLCB memiliki kemampuan yang signifikan untuk menghambat sekresi faktor inflamasi, sedangkan BLAN dan SEAB tidak memiliki efek yang signifikan. Hasilnya pada dasarnya konsisten dengan penelitian sebelumnya. Secara khusus, BLCB secara signifikan mengurangi ekspresi gen Casp1 , yang lebih efektif daripada BLUB, ROSM, JABO, dan KHAC juga memiliki efek yang signifikan. BLCB, JABO, dan SCHI secara signifikan mengurangi ekspresi gen Tnf-α dan IL-6 , tetapi perbedaannya tidak signifikan, dibandingkan dengan BLUB. SPIF, SEAB, dan BLAN tidak memiliki efek yang signifikan. BLCB, SCHI dan ROSM secara signifikan mengurangi ekspresi gen Nlrp3 , dengan perbedaan yang signifikan antara BLCB dan BLUB, diikuti oleh JABO dan KHAC. CHIF, SPIF, SEAB, dan BLAN tidak memiliki efek signifikan dalam mengurangi ekspresi gen Jak2 . BLCB memiliki efek signifikan dalam mengurangi gen Stat3 , tetapi tidak ada perbedaan, dibandingkan dengan BLUB. BLCB, KHAC, JABO, dan ROSM memiliki efek yang jauh lebih baik dalam mengurangi ekspresi gen IL-1β daripada BLUB, diikuti oleh SCHI dan BLCU.

Secara keseluruhan, dibandingkan dengan buah super lainnya, BLCB dan BLUB memiliki keunggulan signifikan dalam menghambat sekresi faktor inflamasi dan mengatur ekspresi gen yang terkait dengan jalur inflamasi. Selain itu, KHAC, JABO, dan BLCU juga memiliki kinerja positif. Meskipun SCHI tidak menonjol dalam regulasi antioksidan dan sitokin inflamasi, ia telah menunjukkan potensi tertentu dalam mengatur gen inflamasi.

4 Diskusi
Cd, sebagai racun lingkungan, menimbulkan risiko kesehatan yang signifikan bagi manusia. Ginjal, sebagai organ target utama akumulasi Cd, sangat rentan terhadap stres oksidatif dan kerusakan inflamasi yang disebabkan oleh Cd. Dalam beberapa tahun terakhir, produk alami semakin mendapat perhatian sebagai agen terapi alternatif dan sumber nutraseutika untuk mencegah dan meringankan patologi ginjal terkait Cd. Antosianin, kelas antioksidan alami dengan kapasitas penangkal radikal bebas yang kuat, banyak terdapat dalam berbagai buah super (de Mello e Silva et al. 2022 ; Prakash dan Baskaran 2018 ). Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa buah super yang disebut Acai berry di wilayah Amazon kaya akan cyanidin-3- O- rutinoside dan C3G, yang memiliki sifat antioksidan yang kuat dan dapat meringankan kerusakan saraf yang disebabkan oleh keracunan metilmerkuri (Crespo-Lopez et al. 2019 ). Namun, penelitian terbatas telah secara sistematis membandingkan potensi perlindungan ekstrak antosianin dari berbagai buah super terhadap stres oksidatif yang disebabkan oleh Cd dan cedera inflamasi pada sel ginjal.

Dalam penyelidikan ini, kami memanfaatkan protokol ekstraksi berbasis etanol konvensional untuk mengisolasi antosianin dari 11 buah super. Analisis kromatografi mengungkapkan 27 senyawa antosianin berbeda di seluruh spesimen yang diuji. Khususnya, SEAB tidak menunjukkan antosianin yang terdeteksi. Namun, kami mengamati bahwa ekstrak SEAB juga dapat menampilkan kinerja tertentu dalam aktivitas antioksidan kimia dan uji viabilitas sel. Ini mungkin disebabkan oleh fakta bahwa antosianin adalah subkelas flavonoid, dan proses ekstraksi mungkin telah menghasilkan senyawa bioaktif lain yang secara struktural serupa yang ada di SEAB. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa SEAB kaya akan polifenol, yang diketahui memberikan efek antiinflamasi (Gore et al. 2025 ). Selain itu, polisakarida SEAB dapat memainkan peran penting dalam peradangan usus akut pada tikus dengan memodulasi mikrobiota usus dan jalur pensinyalan TRAF6/NF-κB (Tian et al. 2024 ).

Dengan membandingkan secara komprehensif jenis dan kandungan antosianin yang diidentifikasi dalam buah super lainnya dengan hasil antioksidan kimia dan efek perlindungan terhadap kerusakan yang disebabkan Cd dalam sel HK-2, kami menemukan bahwa BLCB tampaknya mengungguli BLUB (buah yang sangat dikomoditisasi). Hal ini dibuktikan tidak hanya oleh aktivitas antioksidan BLCB yang unggul tetapi juga oleh efek positifnya yang signifikan pada berbagai metrik, termasuk kelangsungan hidup sel, MDA, ROS, dan NO. Hasil analisis korelasi dan pengelompokan sederhana (Gambar 2C ) selanjutnya menunjukkan hubungan yang erat antara kedua buah tersebut, yang juga memiliki kemiripan yang mencolok dalam penampilan.

Berdasarkan analisis senyawa, BLCB dan BLUB dibandingkan dalam hal jenis dan kandungan antosianin yang terdeteksi. Temuan menunjukkan bahwa BLUB memiliki keunggulan dibandingkan BLCB dalam hal variasi dan total kandungan antosianin. Namun, BLCB mengandung kadar sianidin-3- O- arabinosida yang sangat menonjol (Puncak 12), bersamaan dengan keduanya memiliki keberadaan sianidin-3- O -galaktosida (Puncak 7). Dihipotesiskan bahwa kedua jenis antosianin ini mungkin memiliki potensi manfaat kesehatan yang signifikan. Khususnya, sianidin-3- O – arabinosida telah menarik perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena penelitian yang menunjukkan potensi sifat antitumornya dari sumber buah (Zhang et al. 2022) ).

Lebih jauh lagi, senyawa bersama cyanidin-3- O- galactoside (Peak 7) telah ditunjukkan dalam penelitian sebelumnya untuk melawan efek sitotoksik dari tert-butyl hydroperoxide dalam rentang konsentrasi 0,1 hingga 10 µM. Ini secara efektif mengurangi atau sepenuhnya mencegah kematian sel, pelepasan laktat dehidrogenase (LDH), aktivasi caspase-3, dan kerusakan DNA (Bellocco et al. 2016 ). Ini juga dapat menghambat diferensiasi fibroblas dan mengurangi fibrosis paru yang diinduksi silika melalui jalur Nrf2/p38/Akt/NOX4 (Ma et al. 2022 ). Selain itu, meskipun KHAC menunjukkan efikasi yang lebih rendah daripada BLUB di sebagian besar indikator, perbandingan mengungkapkan potensi antioksidannya. Profil antosianin menunjukkan bahwa cyanidin-3- O- rutinoside adalah yang paling melimpah di KHAC (Peak 10). Penelitian serupa telah menunjukkan bahwa 250 µg/mL cyanidin-3- O- rutinoside menunjukkan efek penghambatan pada LPO (Mulabagal et al. 2009 ).

Selain itu, potensi BLAN untuk memberikan efek tidak terlalu menonjol, yang mungkin disebabkan oleh komposisi antosianinnya yang unik, berbeda dari buah super lainnya. Kami mendeteksi kandungan petunidin-3- O- rut( cis-p-coumaroyl ) -5-O- glc (Puncak 24) yang relatif tinggi di BLAN. Karena strukturnya yang spesifik dan biaya monomernya yang tinggi, penelitian tentang bioaktivitasnya mungkin terbatas. Lebih jauh, hasil percobaan sel menunjukkan bahwa dosis tinggi BLAN menunjukkan toksisitas proliferatif yang signifikan pada sel HK-2, yang menunjukkan bahwa kontrol dosis diperlukan selama aplikasi. Namun, ada minat yang meningkat di antara para peneliti terhadap efek farmakologis BLAN dan potensi manfaat kesehatannya. Studi menunjukkan bahwa BLAN mengandung sejumlah besar alkaloid dan memiliki aktivitas seperti efek antimalaria dan hepatoprotektif (Okokon et al. 2022) ). Dengan demikian, meskipun ekstrak antosianin dari beberapa buah super tidak menunjukkan efek yang luar biasa dalam penelitian ini, potensi keberadaan senyawa bioaktif lain dan manfaat kesehatannya layak ditelusuri lebih lanjut.

Aktivitas antioksidan dan anti-inflamasi adalah jalur mendasar untuk meningkatkan kesehatan secara keseluruhan. Selain jalur antioksidan klasik Nrf2/Keap1 yang disebutkan sebelumnya, penelitian menunjukkan bahwa defisiensi Nrf2 memperburuk cedera ginjal yang disebabkan oleh paparan Cd subakut pada tikus (C. Chen et al. 2021 ), juga melindungi tikus dari fibrosis ginjal yang disebabkan oleh paparan CdCl 2 (C. Chen et al. 2023 ). Studi-studi ini menunjukkan bahwa Nrf2 mungkin merupakan target utama dalam menangani kerusakan jaringan yang disebabkan oleh Cd. Aktivasi jalur antioksidan yang dimediasi Nrf2 oleh antioksidan alami terutama terjadi melalui gangguan interaksi antara Keap1 dan Nrf2 , yang mempromosikan fosforilasi Nrf2 dan mencegah ubikuitinasinya (Fernando et al. 2019 ). Ini mirip dengan efek yang ditunjukkan oleh ekstrak antosianin dalam penelitian ini (Gambar 6 ). Secara bersamaan, analisis peta panas korelasi dilakukan pada indikator studi (Gambar S1 ). Analisis mengungkapkan korelasi positif yang signifikan antara ekstrak antosianin buah super dan aktivitas enzim SOD ( p < 0,01) dan korelasi negatif yang signifikan dengan ekspresi protein IL-6 ( p < 0,01). Total kandungan relatif ekstrak antosianin dari berbagai buah super menunjukkan korelasi positif yang signifikan dengan tingkat antioksidan kimia dan secara signifikan terkait dengan stres oksidatif dan faktor-faktor terkait peradangan, termasuk ROS dan NO. Peta panas korelasi menunjukkan hubungan yang kuat antara stres oksidatif dan faktor-faktor terkait peradangan dengan protein target utama, memberikan referensi tertentu untuk mekanisme potensial di mana ekstrak antosianin buah super dapat meringankan stres oksidatif dan kerusakan inflamasi.
Bahasa Indonesia: Selain jalur antioksidan klasik Nrf2/Keap1 yang disebutkan sebelumnya (Lucky et al. 2024 ), jalur pensinyalan Jak/Stat telah ditemukan dalam beberapa tahun terakhir sebagai jalur transduksi sinyal yang dapat mengatur imunitas dan inflamasi melalui sitokin (Paithankar et al. 2021 ). Selama stres oksidatif, produksi NO biasanya meningkat, dan dalam beberapa kasus, produksi NO dapat menyebabkan peningkatan produksi ROS, yang merangsang aktivasi inflammasom. NLRP3 adalah inflammasom inti yang dimediasi oleh Caspase1 , yang dapat mendorong pelepasan faktor-faktor seperti 1L-1β setelah aktivasi (Simsek et al. 2023 ). Inflammasom JAK2, STAT3, dan NLRP3 merupakan faktor dan protein signifikan yang terkait dengan inflamasi yang dievaluasi di sini. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa jalur pensinyalan JAK2/STAT3 dan gen Klotho berperan dalam neurotoksisitas yang diinduksi Cd baik secara in vitro maupun in vivo (S. Liu et al. 2023 ). Selain itu, piroptosis yang diinduksi Cd pada sel SH-SY5Y dimediasi oleh jalur pensinyalan PERK/TXNIP/NLRP3. Penelitian ini juga menunjukkan bahwa stres oksidatif dan faktor-faktor terkait peradangan yang kami periksa terkait erat dengan kerusakan yang diinduksi Cd dan relatif representatif.

Namun, beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa cedera yang diinduksi Cd juga terkait dengan jalur yang lebih baru, seperti apoptosis, autofagi, dan ferroptosis. Penelitian telah menunjukkan bahwa didimin dapat mengurangi kerusakan ginjal yang diinduksi Cd dengan mengatur jalur Nrf2/Keap1 , serta memengaruhi apoptosis, inflamasi, dan stres oksidatif (Hamza et al. 2025 ). Asam ellagic mengurangi apoptosis yang diinduksi paparan Cd pada sel HT22 dengan mengaktifkan jalur Nrf2/ HO-1 melalui penghambatan stres oksidatif dan disfungsi mitokondria (Y. Liu et al. 2024 ). Aktivasi autofagi yang dimediasi stres retikulum endoplasma terlibat dalam ferroptosis yang diinduksi Cd pada sel epitel tubulus ginjal (Zhao et al. 2021 ).

Selain itu, penelitian kami hanya mengevaluasi efek potensial dari berbagai ekstrak antosianin secara in vitro. Mengingat lingkungan in vivo yang lebih kompleks, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengeksplorasi efek dan mekanisme aksinya terhadap kerusakan jaringan akibat Cd melalui eksperimen in vivo dan berbagai jalur, sehingga memperluas cakupan penelitian.

Bahan buah yang digunakan dalam penyelidikan ini, kecuali BLUB, yang sangat dikomersialkan, sebagian besar tidak dikenal oleh masyarakat umum. Misalnya, KHAC, yang sekarang sebagian besar liar, adalah buah batu yang sebagian besar didistribusikan di Provinsi Yunnan, Provinsi Guizhou, Provinsi Shaanxi di Tiongkok dan negara-negara lain, terutama India (Rymbai et al. 2016 ). KHAC dalam masyarakat Tiongkok disebut “buah merah” karena buahnya yang matang berwarna ungu tua atau ungu hitam. BLCB, asli Amerika Utara, adalah buah beri berwarna gelap berbentuk ceri. Dalam beberapa tahun terakhir, potensinya yang sangat besar untuk promosi kesehatan telah menerima lebih banyak perhatian. Ini telah diolah menjadi suplemen makanan seperti kecap dan teh buah dalam industri makanan (Sidor et al. 2019 ). Kami menemukan bahwa BLCB, KHAC, dan BLCU mungkin memiliki potensi yang lebih baik untuk meringankan stres oksidatif dan kerusakan inflamasi yang disebabkan oleh Cd dalam sel HK-2. Oleh karena itu, ada potensi untuk mengembangkan suplemen makanan atau makanan fungsional berdasarkan buah super ini di masa mendatang.

5 Kesimpulan
Dalam penelitian ini, kami mengumpulkan 11 jenis buah super dan mengkarakterisasi profil antosianin utamanya menggunakan UPLC-Triple-TOF/MS, dengan kuantifikasi kandungan antosianin relatif. Kapasitas antioksidan kimia dari ekstrak ini dievaluasi melalui empat uji in vitro terstandarisasi. Model sel cedera yang diinduksi Cd dibuat dalam sel epitel tubulus ginjal manusia (HK-2) untuk menyelidiki efek perlindungan ekstrak antosianin, dengan fokus pada jalur stres oksidatif Nrf2/Keap1 dan mediator inflamasi. Analisis multidimensi dilakukan untuk menilai kapasitas antioksidan kimia, viabilitas seluler, ekspresi gen, dan regulasi protein.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak antosianin dari buah super secara signifikan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup sel, mengurangi penanda stres oksidatif (ROS dan MDA), menekan pelepasan NO, mengaktifkan enzim antioksidan (misalnya, SOD), meningkatkan kadar T-GSH, dan memodulasi jalur Nrf2/Keap1/Cul3 dengan menurunkan ekspresi Keap1 (KEAP1) dan Cul3 (CUL3) sambil meningkatkan ekspresi Nrf2 (NRF2). Bersamaan dengan itu, ekstrak ini melemahkan respons inflamasi dengan menurunkan mediator utama, termasuk IL-6, IL-1β, TNF-α, STAT3, JAK2, CASP1 dan NLRP3, sehingga menghambat aktivasi inflammasome. Di antara buah super yang diuji, BLUB, BLCB, dan KHAC yang dikomersialkan menunjukkan efek perlindungan yang paling menonjol, diikuti oleh BLCU dan ROSM.

Penelitian ini dapat memberikan evaluasi sistematis antosianin alami dalam mengurangi nefrotoksisitas akibat Cd dan memberikan wawasan berharga untuk mengembangkan intervensi turunan buah super terhadap toksisitas logam berat Cd lingkungan.