ABSTRAK
Untuk meningkatkan efisiensi identifikasi, memperkuat kendali mutu, dan mewujudkan ketertelusuran cepat dan analisis pemalsuan Citri Reticulatae Pericarpium (CRP) dan Citri Reticulatae Pericarpium (XCRP, herba geoauthentic) Xinhui, UHPLC-QTOF-MS dikombinasikan dengan “kartu identitas digital” digunakan untuk mengeksplorasi identifikasi digital CRP. Analisis kimia UHPLC-QTOF-MS dilakukan pada CRP dari asal yang berbeda, dan setelah pemrosesan terkuantisasi, ion-ion bersama diekstraksi dari berbagai kelompok CRP dari asal yang sama sebagai “representasi ion” CRP dari asal yang sama. Selanjutnya, kumpulan data ion unik dari setiap asal relatif terhadap asal lainnya disaring sebagai “kartu identitas digital” CRP dari setiap asal. Selain itu, CRP yang tidak berasal dari Xinhui dicampur dan disiapkan sebagai sampel referensi. Kemudian sampel referensi dan XCRP digunakan untuk mengekstrak “kartu identitas digital” CRP dan XCRP lagi. Berdasarkan pencocokan “kartu identitas digital” di atas dan umpan balik pencocokan kredibilitas (MC) untuk mewujudkan analisis ketertelusuran dan pemalsuan CRP. Hasil penelitian menunjukkan bahwa analisis ketertelusuran dapat diwujudkan secara efektif berdasarkan “kartu identitas digital” CRP dari berbagai asal, dan MC mencapai 90%. Bahkan jika 5% CRP ditambahkan ke XCRP, masih dapat dideteksi secara efektif dalam analisis pemalsuan. Ketertelusuran asal dan analisis pemalsuan GRP dapat diwujudkan berdasarkan analisis UHPLC-QTOF-MS dan “kartu identitas digital” secara efektif dan akurat. Ini memiliki signifikansi referensi penting untuk analisis digital cepat ketertelusuran dan pemalsuan CRP dan kontrol kualitas digital obat-obatan Tiongkok.

1 Pendahuluan
Citri Reticulatae Pericarpium (CRP) adalah pericarp kering dan matang dari Rutaceae Citrus reticulata Blanco dan varietas yang dibudidayakan (Yu, Sun, et al. 2018 ). CRP memiliki nilai obat dan makanan yang kaya. CRP diproduksi secara luas di Hunan, Hubei, Guangxi, dan tempat-tempat lain di Tiongkok; di antara mereka, CRP yang diproduksi di Xinhui (XCRP) dianggap sebagai ramuan geoauthentik yang memiliki harga pasar yang lebih tinggi dan lebih unggul daripada daerah produksi lainnya dalam aplikasi klinis dan fungsi farmakodinamik (Zhang, Jiang, et al. 2024 ). Namun, produksi XCRP terbatas, dan permintaan melebihi pasokan di pasar, sehingga beberapa pedagang yang tidak bermoral memanfaatkan kesamaan CRP dan XCRP dalam penampilan untuk mengganti yang baik dengan yang buruk dan mencari kepentingan ilegal. Oleh karena itu, perlu untuk memperkuat analisis ketertelusuran, pengawasan pasar, dan kontrol kualitas XCRP dan CRP.

Untuk tujuan ini, banyak penelitian telah dilakukan oleh para sarjana yang relevan. Misalnya, Zheng et al. melakukan identifikasi XCRP dan CRP menggunakan UHPLC-Q-TOF-MS/MS dan analisis statistik multivariat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa XCRP dan CRP dapat dibedakan secara efektif, dan biomarker potensial XCRP adalah Rhoifolin dan Diosmetin-6-C-glucoside (Zheng et al. 2019 ). Wang et al. membedakan XCRP dan CRP menggunakan UHPLC-QTOF-MS dan teknik support vector machine (SVM) secara efektif. Lebih jauh, hasil penelitian menunjukkan bahwa komponen seperti nobiletin dan natsudaidin juga dapat menjadi penanda kimia potensial untuk membedakan XCRP dan CRP (Wang et al. 2019 ). Chen et al. melakukan analisis pemalsuan XCRP dan CRP menggunakan FT-NIR dan teknik pembelajaran mesin dan mencapai akurasi model setinggi 98,64% (Chen et al. 2024 ). Selain itu, kromatografi lapis tipis, kromatografi cair kinerja tinggi, dan kode batang DNA juga digunakan untuk analisis ketertelusuran CRP (Zheng et al. 2018 ; Yu, Zhang, et al. 2018 ). Semua penelitian di atas membantu analisis CRP; namun, ada beberapa kekurangan: (1) sebagian besar analisis terkini berfokus pada diskriminasi XCRP dan CRP, bukan pada identifikasi pemalsuan. (2) Bahkan jika metode identifikasi tradisional dapat mencapai identifikasi pemalsuan, itu juga memakan waktu dan padat karya. (3) Di sisi lain, metode identifikasi tradisional hanya didasarkan pada dua atau tiga komponen kimia, yang tidak representatif dan tidak meyakinkan, serta tidak memanfaatkan informasi komponen yang tidak diketahui secara wajar dan efektif.

Mengingat masalah dan kekurangan di atas, dan mempertimbangkan kedatangan era digital, penelitian ini melakukan identifikasi dan analisis pemalsuan XCRP dan CRP berdasarkan karakterisasi digital komponen kimia (Zhang, He, et al. 2024 ; Wang, Zhang, Jing, Guo, et al. 2024 ). Pertama, UHPLC-QTOF-MS digunakan untuk menganalisis CRP dan XCPR di bawah kondisi analisis terpadu. Kedua, perangkat lunak Progenesis QI (Versi 2.4.69) digunakan untuk mendigitalkan spektrometri massa sampel CRP dan XCRP untuk mendapatkan karakterisasi digital komponen kimia. Kemudian, ion bersama diekstraksi dari batch CRP yang berbeda dari asal yang sama sebagai “representasi ion” CRP dari asal yang sama (Wang, Zhang, He, Fu, et al. 2024 ). Lebih jauh, kumpulan data ion unik dari setiap asal relatif terhadap asal lainnya disaring sebagai “kartu identitas digital” CRP dari setiap asal untuk mewujudkan analisis ketertelusuran (Rui Wang et al. 2024 ). Selain itu, CRP yang tidak berasal dari Xinhui dicampur dan disiapkan sebagai sampel referensi. Kemudian sampel referensi dan sampel XCRP digunakan untuk mengekstrak “kartu identitas digital” CRP dan XCRP lagi untuk analisis pemalsuan (Wang, Zhang, Jing, Li, et al. 2024 ). Analisis ketertelusuran dan pemalsuan CRP diwujudkan berdasarkan pencocokan “kartu identitas digital” dan umpan balik pencocokan kredibilitas (MC).

2 Bahan dan Metode
2.1 Bahan Herbal
33 kelompok bahan obat, termasuk CRP Hunan (6 kelompok), CRP Hubei (6 kelompok), CRP Guangxi (6 kelompok), CRP Yunnan (6 kelompok), dan CRP Xinhui (9 kelompok) dikumpulkan oleh Institut Pengawasan Obat dan Makanan Nasional. Semua sampel diidentifikasi oleh laboratorium dan memenuhi persyaratan Farmakope Tiongkok; informasi terperinci tentang bahan ditunjukkan pada Tabel S1 . Selain itu, semua bahan disimpan di tempat yang sejuk dan kering.

2.2 Bahan Reagen
Metanol dengan mutu spektrometri massa (Lot: ED341-CN) dibeli dari Honeywell Trading Co. Ltd. di Shanghai, Cina. Asetonitril dengan mutu spektrometri massa (Lot: 222372) dibeli dari Thermo Fisher Scientific Shier Technology Co. Ltd. di Shanghai, Cina. Asam format dengan mutu spektrometri massa (L1670) dibeli dari Honeywell Trading Co. Ltd. di Shanghai, Cina. Air ultramurni (GB 19298) dibeli dari Watsons Food and Beverage Co. Ltd. di Guangzhou, Cina.

2.3 Pretreatment Sampel
Bahan baku dihancurkan menjadi bubuk dan disaring dengan saringan No. 3. Bubuk CRP dari berbagai daerah (kecuali Xinhui) dicampur untuk membuat 8 sampel referensi untuk mengekstraksi “kartu identitas digital” CRP. Selain itu, berbagai proporsi bubuk CRP dari sampel referensi ditambahkan ke bubuk XCRP (5%, 10%, 20%, 30%, 50%) untuk membuat sampel positif campuran. Timbang secara akurat 1,00 g bubuk bahan herbal kering untuk ditempatkan dalam botol runcing 50 mL dengan sumbat masing-masing; kemudian tambahkan secara akurat 25,00 mL metanol dengan pipet ke dalam botol runcing untuk melakukan ultrasound selama 30 menit (daya: 500 W, frekuensi: 40 kHz); Akhirnya dikeluarkan dan didinginkan hingga suhu kamar, serta disaring dengan membran filter 0,22 μm untuk mendapatkan sampel. Sampel disimpan pada suhu 4 ° C dalam lemari es sebelum analisis UHPLC-QTOF-MS.

2.4 Kondisi Analisis UHPLC-QTOF-MS
Analisis UHPLC-QTOF-MS dilakukan pada Waters Xevo G2-XS QTof (Waters, AS). Pemisahan kromatografi dilakukan pada kolom kromatografi Waters Acquity UPLC BEH-C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) (Lot: 186002352 Waters, AS) dan suhu kolom diprogram pada 35°C (Zhang, He, et al. 2024 ). Fase mobilnya adalah 0,1% asam format dalam air (A)-asetonitril (B), dan kondisi elusi gradiennya adalah sebagai berikut: 0–23 menit, 5%–95% B; 23–26 menit, 95% B; 26–26,01 menit, 95%–5% B; 26,01–30 menit, 5% B. Volume injeksi adalah 2 μL. Spektrometri massa Waters mengadopsi metode ESI+ dan MS E dengan laju akuisisi data 0,2 detik; Rentang m / z adalah 100–1500; gas tumbukan adalah argon dengan kemurnian tinggi, dan larutan kalibrasi sumbu massa waktu nyata (massa kunci) adalah Leusin Enkefalin (LE) pada konsentrasi 200 ng/mL. Selain itu, kapiler: 3,0 kV; kerucut pengambilan sampel: 40 V; offset sumber: 80 V; suhu desolvasi: 450°C; gas desolvasi: 900 L/jam; energi tumbukan: 10–40 V; serta suhu sumber: 120°C. Sebelum analisis sampel, kalibrasi sumbu massa dan massa kunci dilakukan.

2.5 Algoritma Alur Pengolahan Data dan Identifikasi
Spektrometri massa CRP, XCRP, dan pelarut kosong diproses oleh Progenesis QI dengan parameter sebagai berikut: Jenis mesin: resolusi tinggi; Polaritas: Positif; Batas pengambilan puncak: otomatis; Waktu retensi: 1,00–26,00 menit. Berdasarkan parameter di atas, kami memperoleh data terkuantisasi setiap sampel, termasuk waktu retensi (Rt), rasio massa terhadap muatan ( m / z ), dan kekuatan ionik ( I ) (Wang, Zhang, He, Fu, et al. 2024 ; Wang, Zhang, Jing, Li, et al. 2024 ). Selanjutnya, data terkuantisasi yang diperoleh disimpan sebagai “file CSV” dalam format matriks digital.

Alur algoritma diimplementasikan dengan bahasa Java dan dapat dibagi menjadi beberapa langkah berikut (Wang, Zhang, He, Fu, et al. 2024 ; Hou et al. 2023 ):

1. Deduksi kosong: untuk menghilangkan ion pengganggu yang berasal dari substrat kosong di semua sampel, yang dapat memperkuat akurasi kecocokan. Algoritme di atas akan menilai apakah ion dalam sampel berasal dari substrat kosong dan menghapusnya menggunakan kriteria berikut: ion dalam sampel dan substrat kosong memiliki Rt dan m / z yang serupa (ΔRt ≤ 0,05 min dan Δ m / z  ≤ 0,05 Da) (Zhang, He, et al.  2024 ).
2. Akuisisi “kartu identitas digital”: pertama, ion-ion yang dibagi diekstraksi dari spektrum massa berbagai batch CRP dari wilayah yang sama dan dihilangkan ion-ion yang serupa secara berulang sebagai “karakterisasi ion” CRP di wilayah ini di mana ion-ion yang dibagi dan ion-ion serupa memiliki Rt dan m / z yang serupa (ΔRt ≤ 0,05 min dan Δ m / z  ≤ 0,05 Da). Kemudian kumpulan ion-ion unik dari setiap asal relatif terhadap asal-usul lainnya disaring dari setiap asal dengan membandingkan antara masing-masing ion yang dibagi atau antara ion-ion yang dibagi dan data mentah. Akhirnya ion-ion N teratas dipertahankan sebagai “kartu identitas digital” untuk CRP dari setiap asal, masing-masing berdasarkan pada urutan kekuatan ionik (Wang, Zhang, Jing, Li, et al.  2024 ; Hou et al.  2023 ).
3. Identifikasi pencocokan: untuk mewujudkan analisis ketertelusuran asal, “kartu identitas digital” CRP dari berbagai wilayah digunakan sebagai tolok ukur untuk identifikasi pencocokan CRP guna memberikan umpan balik kredibilitas pencocokan (MC). Dalam proses ini, kriteria untuk identifikasi pencocokan adalah sebagai berikut: ion dalam “kartu identitas digital” dan sampel yang akan diidentifikasi memiliki Rt dan m/z yang serupa. Rumus MC adalah sebagai berikut (Zhang, He, et al.  2024 ; Hou et al.  2023 ):
4. Analisis ketertelusuran asal CRP: berdasarkan metode di atas (1–3), CRP dari asal yang berbeda dianalisis dengan UHPLC-QTOF-MS/MS dan digunakan untuk mengekstrak “kartu identitas digital” CRP, sementara itu, 6 kelompok XCRP dalam Tabel  1 digunakan untuk mengekstrak “kartu identitas digital” XCRP (ramuan geoauthentik) di mana ion-ion unik dibandingkan antara ion-ion yang dibagikan. Kemudian, “kartu identitas digital” CRP dan XCRP digunakan sebagai tolok ukur untuk analisis pemalsuan guna memberikan umpan balik tentang kredibilitas pencocokan (MC).
5. Analisis pemalsuan: berdasarkan metode di atas (1–3), 8 sampel referensi dianalisis dengan UHPLC-QTOF-MS/MS dan digunakan untuk mengekstrak “kartu identitas digital” CRP, sementara itu, 6 kelompok XCRP dalam Tabel  1 digunakan untuk mengekstrak “kartu identitas digital” XCRP (ramuan geoauthentik) di mana ion-ion unik dibandingkan antara ion-ion bersama dan data mentah. Kemudian “kartu identitas digital” CRP dan XCRP digunakan sebagai tolok ukur untuk analisis pemalsuan guna memberikan umpan balik tentang kredibilitas pencocokan (MC).
   
   TABEL 1. Jumlah unit [Rt −  m / z  −  I ] di CRP di berbagai wilayah.

   Herbal	Asal	Kelompok	Nomor	Herbal	Asal	Kelompok	Nomor
   Bahasa Indonesia: CRP	Xinhui	Bahasa Indonesia: XH01	3080	Bahasa Indonesia: CRP	Provinsi Hubei	Bahasa Indonesia: HB01	3883
   	Xinhui	XH02	3400		Provinsi Hubei	Bahasa Indonesia: HB02	3951
   	Xinhui	Bahasa Indonesia: XH04	3786		Provinsi Hubei	Nomor HB04	4805
   	Xinhui	XH05	4104		Provinsi Hubei	Bahasa Indonesia: HB05	5115
   	Xinhui	Bahasa Indonesia: XH07	3911		Guangxi	GX01	4327
   	Xinhui	Bahasa Indonesia: XH08	3894		Guangxi	GX02	4157
   	Bahasa Hunan	HN01	5569		Guangxi	GX04	3786
   	Bahasa Hunan	HN02	5111		Guangxi	GX05	5189
   	Bahasa Hunan	HN04	4743		Yunnan	YN01	3714
   	Bahasa Hunan	HN05	5986		Yunnan	YN02	3597
   	Yunnan	YN04	4159		Yunnan	YN05	4434

3 Hasil
3.1 Analisis UHPLC-QTOF-MS
Berdasarkan pemrosesan sampel dan kondisi eksperimen, kami memperoleh kromatogram puncak-dasar CRP dari berbagai daerah. Kromatogram puncak-dasar dari blanko dan beberapa sampel ditunjukkan pada Gambar 1 .

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1 , CRP di berbagai daerah menunjukkan kromatogram puncak-basa yang serupa dalam kondisi deteksi yang sama, yang berarti bahwa perbedaan kromatogram puncak-basa CRP dari berbagai tempat tidak jelas, sehingga sangat sulit untuk membedakan asal CRP hanya dengan kromatogram puncak-basa, dan perlu analisis identifikasi digital lebih lanjut untuk mewujudkan studi ketertelusuran asal dan pemalsuan.

3.2 Pemrosesan Digital
Dalam makalah ini, informasi spektrometri massa pelarut metanol diambil sebagai “kosong,” dan masing-masing berisi 3429–4464 unit [Rt −  m / z  −  I ] setelah diubah menjadi matriks data oleh Progenesis QI. Nilai rata-rata adalah 4022 dengan RSD = 9,75%. Untuk CRP dari berbagai wilayah yang digunakan untuk mengekstrak “kartu identitas digital,” jumlah unit [Rt −  m / z  −  I ] CRP ditunjukkan pada Tabel 1 .

Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 , jumlah [Rt −  m / z  −  I ] dari XCRP semuanya melebihi 3000, yang mana XCRP dengan nomor batch XH05 memiliki 4104 [Rt −  m / z  −  I ] unit, sementara itu hanya ada 3080 [Rt −  m / z  −  I ] unit di XCRP dengan nomor batch XH01. Selain itu, jumlah [Rt −  m / z  −  I ] dari CRP Hubei dan Guangxi semuanya melebihi 3700, yang mana CRP dengan nomor batch GX05 memiliki 5189 [Rt −  m / z  −  I ] unit, tetapi hanya ada 3883 [Rt −  m / z  −  I ] unit di CRP dengan nomor batch HB01. Hasil di atas menunjukkan bahwa ada beberapa perbedaan dalam jumlah unit [Rt −  m / z  −  I ] dalam batch CRP yang berbeda di wilayah yang sama atau CRP di wilayah yang berbeda. Itu juga menggambarkan dari sisi bahwa informasi spektrometri massa sampel dari batch atau wilayah CRP yang berbeda berbeda, dan ada komponen kimia yang berbeda pada tingkat molekuler yang disebabkan oleh area produksi yang berbeda, waktu penyimpanan, dan perbedaan individu, yang sejalan dengan situasi sebenarnya. Di sisi lain, pasti ada perbedaan antara bahan obat yang sama dari tempat yang berbeda atau batch yang berbeda dari bahan obat yang sama dari tempat yang sama, yang juga menunjukkan bahwa kita harus secara komprehensif mempertimbangkan batch yang berbeda, tahun yang berbeda atau wilayah CRP yang berbeda untuk mendapatkan “kartu identitas digital” CRP dan XCRP yang akurat.

Selain itu, perbedaan antara kelompok yang berbeda dari herba yang sama tidak memengaruhi penelitian ini. Penelitian ini terutama mengandalkan representasi digital komponen kimia melalui spektrometri massa pada tingkat molekuler untuk mengekstrak data bersama sebagai matriks digital inti dan menyusun “kartu identitas digital” CRP. Ide penelitian difokuskan pada komponen kimia umum dari kelompok yang berbeda (atau wilayah yang berbeda) dari herba yang sama, bukan pada komponen yang berbeda. Selain itu, karakterisasi digital informasi spektrometri massa digunakan sebagai pengganti identifikasi senyawa, yang dapat sangat meningkatkan efisiensi analisis melalui pencocokan dan perbandingan digital (Zhang, He, et al. 2024 ).

3.3 Akuisisi “Kartu Identitas Digital” CRP dan XCRP
Berdasarkan digitalisasi spektrometri massa, berbagai batch CRP dari berbagai area produksi pada Tabel 1 digunakan untuk mengekstrak data bersama mereka sebagai “kartu identitas digital” masing-masing. Setelah mengekstrak data umum, ion-ion pengganggu yang ada secara bersamaan dalam pelarut metanol dan sampel dihilangkan. Selama langkah-langkah de-blanking dan ekstraksi data bersama di atas, ambang batas parameter waktu retensi (Rt) dan rasio massa terhadap muatan ( m / z ) ditetapkan dalam bundel sebagai ΔRt ≤ 0,05 menit dan Δm / z ≤  0,05 Da. Artinya, semua data spektrometri massa yang memenuhi deviasi ambang batas dibangun dalam matriks data baru. Selanjutnya, 100 matriks data [Rt −  m / z  −  I ] teratas disaring sebagai “kartu identitas digital” CRP di berbagai wilayah, masing-masing, berdasarkan pada urutan kekuatan ionik. Alur pemrosesan di atas semuanya diwujudkan dengan menggunakan bahasa pemrograman JAVA.

Dalam akuisisi CRP dengan “kartu identitas digital” di berbagai wilayah, kami menyelidiki waktu retensi (Rt) dan ambang batas rasio massa terhadap muatan ( m / z ) yang berbeda. Awalnya, kami menetapkan ambang batas deviasi waktu retensi (Rt) dan rasio massa terhadap muatan ( m / z ) masing-masing sebesar ΔRt ≤ 0,05 menit dan Δm / z ≤  0 Da. Namun, ion bersama tidak dapat diperoleh dalam kondisi yang keras ini. Lebih lanjut, Rt dan m / z ditetapkan sebesar ΔRt ≤ 0,05 menit dan Δm / z ≤  0,01 Da, ion bersama dalam CRP Guangxi dan Yunnan semuanya kurang dari 100, yang tidak memungkinkan kami untuk melakukan penyaringan fitur lebih lanjut menurut kekuatan ion. Ketika Rt dan m / z ditetapkan sebagai ΔRt ≤ 0,05 min dan Δ m / z  ≤ 0,05 Da, ion-ion bersama dalam CRP dari berbagai daerah semuanya lebih tinggi dari 1000, yang memberi kita ruang pemrosesan tertentu untuk melakukan penyaringan fitur menurut kekuatan ionik. Hal di atas terutama disebabkan oleh keadaan instrumen yang berbeda dalam periode yang berbeda, dan mendeteksi kumpulan sampel CRP yang berbeda dalam periode yang berbeda memang dapat menimbulkan galat. Selain itu, perbedaan lingkungan eksternal juga dapat menimbulkan penyimpangan, terutama suhu laboratorium. Hal ini juga menunjukkan bahwa kita harus menetapkan ambang batas penyimpangan yang wajar dari Rt dan m / z untuk mengekstrak data bersama. Untuk memastikan jumlah ion yang dibagi dan ruang untuk penyaringan menurut kekuatan ion, berdasarkan rujukan pada literatur yang relevan (Hou et al. 2023 ; Li et al. 2023 ), kami akhirnya menentukan bahwa ambang batas parameter adalah ΔRt ≤ 0,05 min dan Δ m / z  ≤ 0,05 Da. Pada saat yang sama, Rt memang bergeser tetapi tidak melebihi 0,05 min, sehingga tetap tidak berubah pada 0,05 min dalam pengaturan ambang batas deviasi Rt.

3.4 Analisis Ketertelusuran Asal CRP di Berbagai Wilayah
Pertama, sampel CRP di berbagai wilayah yang digunakan untuk ketertelusuran asal diproses oleh UHPLC-QTOF-MS untuk memperoleh informasi spektrometri massa, yang diubah menjadi matriks data terkuantisasi oleh Progenesis QI. Kemudian “kartu identitas digital” CRP di berbagai wilayah sebagai tolok ukur untuk mencocokkannya dengan matriks data CRP yang digunakan untuk ketertelusuran asal secara berurutan untuk memberikan umpan balik pada kredibilitas pencocokan (MC). Analisis ketertelusuran asal dilakukan menurut MC.

Dalam analisis ketertelusuran asal CRP di berbagai wilayah, ambang deviasi Rt dan m/z ditetapkan sebagai ΔRt ≤ 0,05 min dan Δ m / z  ≤ 0,05 Da. Sebelas kelompok sampel uji, termasuk 3 kelompok XCRP, 2 kelompok CRP Hunan, 2 kelompok CRP Hubei, 2 kelompok CRP Guangxi, dan 2 kelompok CRP Yunnan. Hasil pencocokan XCRP ditunjukkan dalam Tabel 2. Seperti ditunjukkan dalam Tabel 2 , MC XCRP dalam kelompok yang berbeda dibandingkan dengan “kartu identitas digital” XCRP semuanya tidak kurang dari 95,00%, di mana MC XCRP dalam kelompok XH03 dan XH06 semuanya 100%, diikuti oleh XCRP dalam kelompok XH09 dengan MC = 95,00%. Pada saat yang sama, MC tidak lebih tinggi dari 43,00% ketika XCRP dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP Hunan, CRP Hubei, CRP Guangxi, dan CRP Yunnan. MC XCRP dibandingkan dengan “kartu identitas digital”-nya sendiri setidaknya 2,2 kali lipat dari XCRP dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP di empat wilayah lainnya. Tabel 3 menunjukkan hasil pencocokan CRP Guangxi, dan dapat dilihat bahwa MC CRP Guangxi dengan nomor batch GX03 dan GX06 masing-masing adalah 91,00% dan 109,00%, ketika dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP Guangxi sendiri. Sementara itu, dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP di empat wilayah lainnya, CRP Guangxi dengan batch GX03 memiliki MC maksimum = 39,00% saat dicocokkan dengan “kartu identitas digital” CRP Yunnan. Perlu dicatat bahwa alasan mengapa MC lebih besar dari 100% adalah karena adanya ambang deviasi, yang mengarah pada fenomena bahwa satu ion dalam “kartu identitas digital” dapat mencocokkan beberapa ion sampel dalam rentang deviasi ambang batas yang ditetapkan. Misalnya, baik m / z 258,08 [M + H] + dan m / z 258,18 [M + 2H] + dalam sampel GX06 dapat dicocokkan dengan m / z 258,13 dalam “kartu identitas digital” CRP Guangxi. Tabel 4 menunjukkan hasil pencocokan CRP Hunan. MC CRP Hunan dibandingkan dengan “kartu identitas digital”-nya tidak kurang dari 92,00% dan MC CRP Hunan dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP di empat wilayah lainnya tidak lebih tinggi dari 42,00%, yang merupakan selisih lebih dari 2 kali lipat dalam MC. Selain itu, seperti yang ditunjukkan pada Tabel S2 dan S3 , MC CRP Hubei dan CRP Yunnan dibandingkan dengan “kartu identitas digital” mereka sendiri semuanya tidak kurang dari 90,00%. Namun dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP non-diri, MC CRP Hubei dan CRP Yunnan semuanya tidak lebih tinggi dari 43,00%, yang jauh lebih rendah daripada MC jika dibandingkan dengan “kartu identitas digital” mereka sendiri.

TABEL 2. Hasil pencocokan kredibilitas XCRP.

 

TABEL 3. Hasil pencocokan kredibilitas CRP Guangxi.

 

TABEL 4. Hasil pencocokan kredibilitas CRP Hunan.

Hasil di atas menunjukkan bahwa terdapat perbedaan signifikan dalam MC yang diperoleh melalui pencocokan data sampel dengan “kartu identitas digital” CRP dari berbagai daerah. Singkatnya, MC tidak kurang dari 90% jika dibandingkan dengan “kartu identitas digital” mereka sendiri sementara MC tidak lebih dari 43% jika dibandingkan dengan “kartu identitas digital” non-diri, di mana MC bervariasi hingga 47 poin dan lebih dari satu kali. Hal ini juga lebih lanjut menggambarkan bahwa “kartu identitas digital” CRP dari asal yang berbeda memiliki spesifisitas tertentu. Berdasarkan “kartu identitas digital” CRP dari asal yang berbeda, analisis ketertelusuran CRP dapat diwujudkan.

Dalam proses analisis, kecocokan ketika 100, 150, dan 200 teratas [Rt −  m / z  −  I ] dikeluarkan sebagai “kartu identitas digital” CRP dari asal yang berbeda, menurut urutan kekuatan ionik, dieksplorasi. Hasilnya menggambarkan bahwa MC menunjukkan tren sedikit menurun dengan peningkatan jumlah ion. Misalnya, MC XH03 adalah 98,66% jika dibandingkan dengan “kartu identitas digital” XCRP yang berisi 150 teratas [Rt −  m / z  −  I ], dan MC = 97,00% jika dibandingkan dengan “kartu identitas digital” XCRP yang berisi 200 teratas [Rt −  m / z  −  I ]. MC dari HB06 adalah 85,33% ketika “kartu identitas digital” CRP Hubei berisi 150 teratas [Rt −  m / z  −  I ], dan MC = 84,00% ketika “kartu identitas digital” CRP Hubei berisi 200 teratas [Rt −  m / z  −  I ]. Semua di atas lebih rendah daripada MC dalam Tabel 2 dan S2 . Akhirnya, 100 teratas [Rt −  m / z  −  I ] dikeluarkan sebagai “kartu identitas digital” CRP dari asal yang berbeda.

3.5 Analisis Identifikasi Pemalsuan
Dalam analisis identifikasi pemalsuan, 100 [Rt −  m / z  −  I ] teratas juga dikeluarkan sebagai “kartu identitas digital” XCRP dan sampel referensi. Dengan mengambil “kartu identitas digital” XCRP dan sampel referensi (CRP) sebagai tolok ukur untuk mencocokkan sampel positif campuran, ambang batas deviasi Rt dan m / z adalah ΔRt ≤ 0,05 min dan Δ m / z  ≤ 0,05 Da. Hasil pencocokan ditunjukkan pada Gambar 2 dan 3 .

Seperti yang diilustrasikan pada Gambar 2 , dengan meningkatnya proporsi CRP dalam sampel campuran, MC antara sampel campuran dan “kartu identitas digital” CRP semakin tinggi, dan menunjukkan tren naik secara keseluruhan. Ketika tidak ada CRP dalam sampel, MC antara XCRP dan “kartu identitas digital” CRP hanya 9%. Sementara itu, MC = 34% antara sampel campuran dengan 5% CRP dan CRP “kartu identitas digital,” yang lebih dari 3,7 kali lipat dari “0% CRP.” Dari sampel campuran dengan 10% CRP ke sampel campuran dengan 50% CRP, MC semuanya lebih besar dari 50%, di mana MC tertinggi 30% CRP adalah 72%. Ketika tidak ada XCRP dalam sampel, MC antara 100% CRP dengan CRP “kartu identitas digital” naik hingga 90%. Pada saat yang sama, hasil pencocokan sampel dibandingkan dengan “kartu identitas digital” XCRP ditunjukkan pada Gambar 3 , dari sampel dengan 0% CRP ke sampel dengan 50% CRP, MC semuanya lebih besar dari 80%. Selain itu, MC antara 100% CRP dengan “kartu identitas digital” XCRP hanya 11%. Berdasarkan analisis komprehensif Gambar 2 dan 3 , berdasarkan “kartu identitas digital” CRP dan XCRP, bahkan jika hanya 5% CRP yang ditambahkan ke sampel campuran, itu masih dapat dideteksi secara efektif menurut kredibilitas pencocokan. Itu juga menggambarkan bahwa “kartu identitas digital” XCRP dan CRP memiliki spesifisitas tertentu dan dapat mewujudkan analisis identifikasi pemalsuan CRP. Melalui analisis identifikasi pemalsuan dan pertimbangan ambang batas deviasi serta fluktuasi data deteksi, kami mengusulkan agar ambang batas MC ditetapkan sebesar 50%, artinya, ketika sampel yang tidak diketahui dicocokkan dengan “kartu identitas digital” CRP, MC yang lebih besar dari 50% dianggap terdeteksi.

4 Diskusi
4.1 Pembahasan Kondisi Percobaan UHPLC-QTOF-MS
UHPLC-QTOF-MS banyak digunakan dalam bidang analisis tanaman herbal, yang dapat memberi kita informasi data besar yang mencerminkan komponen kimia (Lee et al. 2021 ; Wang, Wu, Li, Guo, et al. 2024 ). Dalam makalah ini, kami juga mengeksplorasi metode praperlakuan sampel, seperti ekstraksi pelarut metanol dan air di bawah ultrasound atau refluks pemanasan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa data spektrometri massa yang diperoleh ketika metanol digunakan sebagai pelarut ekstraksi secara signifikan lebih tinggi daripada air; selain itu, pada dasarnya tidak ada perbedaan antara perlakuan ekstraksi ultrasonik dan refluks panas (Zhang, He, et al. 2024 ). Jadi kami akhirnya memilih ekstraksi ultrasonik (daya: 500 W, frekuensi: 40 kHz) dengan metanol sebagai pelarut selama 30 menit. Selain itu, kami menggunakan mode akuisisi data-independen MSE untuk memperoleh ion induk dan ion fragmen sekunder pada saat yang sama, sehingga memastikan lebih banyak informasi data (Wang, Wu, Li, Guo, et al. 2024 ). Selain itu, kami menyelidiki informasi spektrum massa CRP ketika energi tumbukan masing-masing adalah 10–30, 10–40, dan 10–50 V. Jelas bahwa spektrum massa memiliki informasi data yang paling melimpah dengan energi tumbukan sebesar 10–40 V (Zhang, He, et al. 2024 ; Wang, Wu, Li, Guo, et al. 2024 ).

Sedangkan untuk penanganan sampel, untuk mengekstrak komponen kimia dalam CRP dan XCRP dengan lebih baik, sampel dihancurkan menjadi bubuk dan disaring dengan saringan No. 3. Di pasaran, produk utamanya adalah CRP dan XCRP utuh. Namun, rasio pemalsuan sampel utuh sulit untuk akurat. Oleh karena itu, dalam analisis pemalsuan, bubuk sampel digunakan untuk menyiapkan sampel positif dengan rasio pemalsuan yang akurat. Analisis pemalsuan menggunakan bubuk sampel tidak memengaruhi hasil analisis. Bahkan analisis UHPLC-QTOF-MS dari CRP utuh perlu dihancurkan dan diekstraksi.

4.2 Pembahasan “Kartu Identitas Digital”
Dalam analisis ketertelusuran, akuisisi “kartu identitas digital” didasarkan pada sampel dari kelompok yang berbeda dalam asal yang sama untuk mengekstrak data bersama, yang memastikan kontrol maksimum perbedaan dalam CRP dari asal yang sama. Kemudian, kumpulan ion unik dari setiap asal relatif terhadap asal lainnya disaring dari setiap asal dengan membandingkan antara ion bersama masing-masing dari kelompok yang berbeda dalam asal yang sama. Praktik di atas juga mempertimbangkan sepenuhnya perbedaan antara CRP dari asal yang berbeda. Pada saat yang sama, dalam analisis pemalsuan, kami mengklasifikasikan XCRP sebagai ramuan geoautentik dan membagi CRP Guangxi, CRP Hunan, CRP Hubei, dan CRP Yunnan menjadi ramuan non-geoatentik. Selanjutnya, CRP dicampur untuk membuat 8 sampel referensi, yang digunakan untuk mengekstrak “kartu identitas digital” dari CRP. Hal ini memastikan bahwa data dari CRP dan XCRP seimbang dan kecil kemungkinannya menghasilkan positif palsu, dan memperhitungkan CRP dari berbagai daerah produksi, yang meningkatkan penerapan dan akurasi. Selain itu, perbandingan pencocokan antara ion bersama berdasarkan CRP dari berbagai asal tidak dapat memenuhi kebutuhan analisis pemalsuan saat mengekstraksi “kartu identitas digital”. Misalnya, MC = 47% saat 0% CRP (XCRP) dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP, dan MC = 66% saat 5% CRP dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP yang mana terdapat perbedaan, tetapi tidak signifikan, antara MC. Jadi kami mengubah strategi kami dengan membandingkan secara berurutan ion bersama CRP dengan data asli yang digunakan untuk mengekstraksi “kartu identitas digital” XCRP dan menghapus ion umum untuk mendapatkan “kartu identitas digital” CRP. Demikian pula, metode di atas digunakan untuk mendapatkan “kartu identitas digital” XCRP. Pendekatan ini dapat meningkatkan perbedaan antar MC secara signifikan. Misalnya, MC = 9% ketika CRP 0% (XCRP) dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP dan MC = 34% ketika CRP 5% dibandingkan dengan “kartu identitas digital” CRP yang memiliki perbedaan signifikan antar MC. Pada saat yang sama, MC = 11% ketika CRP 100% dibandingkan dengan “kartu identitas digital” XCRP. Jadi, kami menggunakan metode ini untuk mengekstrak “kartu identitas digital” untuk analisis pemalsuan.

Di sisi lain, dibandingkan dengan penelitian sebelumnya (Wang, Zhang, He, Fu, et al. 2024 ; Hou et al. 2023 ), “kartu identitas digital” tidak hanya inovatif dalam konsep tetapi juga dalam algoritma. “Kartu identitas digital” tidak lagi ion tetap dan terbatas tetapi dapat diperbarui secara dinamis dengan peningkatan batch sampel, sehingga lebih cocok untuk analisis praktis. Batas 1,0 × 104 untuk intensitas ion telah dihapus, memastikan lebih banyak informasi data ion. Langkah algoritma eliminasi untuk membandingkan data ion bersama dengan data asli ditambahkan, sehingga memastikan spesifisitas yang lebih baik. Ambang deviasi dan jendela keluaran ion dipertahankan, memungkinkan pengoptimalan Rt, deviasi m / z , dan jumlah ion yang dikeluarkan sesuai dengan kebutuhan analitis, membuat analisis lebih nyaman. Akhirnya, implementasi algoritma “kartu identitas digital” mengadopsi desain multi-utas, yang dapat sangat menghemat waktu pencocokan dan perbandingan dan meningkatkan efisiensi identifikasi. Selain itu, dibandingkan dengan analisis pemalsuan komposisi kimia sebelumnya (Chen et al. 2024 ), “kartu identitas digital” mewujudkan identifikasi XCRP yang dipalsukan CRP berdasarkan penggunaan komposisi kimia yang tidak diketahui secara rasional dan efektif untuk pertama kalinya. Kartu ini dapat mengidentifikasi CRP dalam XCRP secara efisien dan akurat.

4.3 Identifikasi Digital Tanaman Obat
Dengan datangnya era informasi digital pengobatan Tiongkok, analisis identifikasi pengobatan tanaman dapat dengan cepat mewujudkan identifikasi digital pada tingkat individu, yang kondusif bagi terobosan teknologi deteksi cepat (Zhang et al. 2023 ; Zhu et al. 2023 ; Nair 2022 ; Cao et al. 2021 ). Dalam makalah ini, “kartu identitas digital” CRP dan XCRP memiliki spesifisitas dan representasi tertentu, yang dapat memberikan referensi untuk pembentukan “kartu identitas digital” pengobatan tanaman dan menyediakan cara untuk mewujudkan identifikasi digital pengobatan tanaman. Keuntungan identifikasi digital berdasarkan “kartu identitas digital” adalah tidak perlu mengidentifikasi struktur senyawa dan rumus molekul tertentu, dan dapat menggabungkan semua data terkuantisasi yang diperoleh ke dalam matriks digital untuk mengkarakterisasi pengobatan tanaman secara digital. Metode ini berfokus pada identifikasi herbal pada tingkat individu dan tidak lagi terbatas pada beberapa senyawa dengan struktur yang jelas dan rumus molekul yang diketahui. Pada saat yang sama, ia dapat memanfaatkan sepenuhnya informasi terkuantisasi dari komponen yang tidak diketahui untuk membuat analisis identifikasi lebih masuk akal dan dapat diandalkan.

4.4 Keterbatasan dan Perspektif Penelitian
Harus diakui, penelitian ini juga memiliki beberapa keterbatasan. 33 kelompok sampel yang digunakan dalam penelitian ini ditugaskan ke NIFDC untuk dikumpulkan. Ukuran sampel relatif kecil dan tidak sepenuhnya mencakup variasi sampel. Sampel lebih lanjut perlu dikumpulkan untuk analisis selanjutnya. Untungnya, algoritma “kartu identitas digital” dapat memperluas sampel kapan saja. Selain itu, ia berfokus pada komponen kimia umum CRP dalam asal yang sama daripada komponen kimia diferensial, dan komponen kimia CRP yang berbeda dalam asal yang berbeda. Oleh karena itu, ia dapat mengendalikan pengaruh perbedaan sampel sampai batas tertentu. Selain itu, penelitian metodologis dapat dilakukan berdasarkan “kartu identitas digital” untuk membangun sistem metodologi identifikasi ilmiah untuk membantu pengawasan kualitas CRP.