ABSTRAK
Psilocybin, alkaloid turunan triptamin, telah diberikan sebutan Terapi Terobosan oleh FDA AS untuk pengobatan depresi yang resistan, yang menggarisbawahi pentingnya klinisnya. Oleh karena itu, produksi yang berkelanjutan dan ekonomis sangat dibutuhkan. Pembuatan psilocybin dalam Escherichia coli telah menarik perhatian besar. Namun, karena ekspresi dan aktivitas enzim sitokrom P450 eukariotik PsiH yang rendah dalam jalur biosintesis psilocybin, sintesis de novo psilocybin dalam sel prokariotik telah terhambat. Untuk mengatasi dilema ini, kami di sini menunjukkan sintesis de novo psilocybin dalam E. coli dengan membangun varian PsiH dengan modifikasi domain N-terminal dan mengekspresikan seluruh jalur biosintesis pada suhu rendah yang sesuai. Peningkatan pasokan prekursor dan rekayasa rantai transfer elektron P450 menghasilkan peningkatan 33 kali lipat dalam titer norbaeocystin (105,3 mg/L), perantara utama biosintesis psilocybin, dan peningkatan 17 kali lipat dalam titer psilocybin (14 mg/L). Peningkatan lebih lanjut produksi psilocybin dicapai dengan mengubah norbaeocystin menjadi psilocybin dengan mengekspresikan lebih dari salinan ekstra gen metiltransferase psiM . Akhirnya, 79,4 mg/L psilocybin diproduksi dengan mengoptimalkan kondisi fermentasi labu, peningkatan 100 kali lipat dari strain awal. Pekerjaan kami menunjukkan keberhasilan rekayasa jamur P450 untuk meningkatkan aktivitas katalitik dalam E. coli dan akan memajukan produksi berkelanjutan dari psilocybin antidepresan penting dalam sel mikroba prokariotik.

Abstrak Grafis
Pekerjaan kami menghasilkan sintesis de novo psilocybin antidepresan dalam satu sel Escherichia coli yang direkayasa . Dengan membangun varian P450 PsiH dengan modifikasi domain hidrofobik N-terminal, meningkatkan pasokan prekursor triptofan dan kofaktor NADPH, meningkatkan jalur transfer elektron (ET) dan langkah metilasi akhir, dan mengoptimalkan kondisi fermentasi, galur E. coli yang direkayasa menghasilkan psilocybin dengan titer 79,4 mg/L dalam fermentasi labu. Pekerjaan kami menyediakan rute berkelanjutan untuk memenuhi produksi industri dan aplikasi farmasi psilocybin.

1 Pendahuluan
Psilocybin adalah alkaloid turunan triptamin yang diisolasi terutama dari genus basidiomycete Psilocybe , yang disebut “jamur ajaib”. Obat pendahulu psilocybin tidak psikoaktif, tetapi turunan defosforilasinya psilocin secara struktural mirip dengan neurotransmitter, seperti serotonin, dan dapat bertindak secara agonis pada reseptor 5-HT 2A dalam sistem saraf pusat manusia (Nichols 2004 ). Tidak mengherankan, psilocybin telah digunakan dalam penelitian farmakologis dan terapeutik untuk pengobatan gangguan terkait saraf (Bogenschutz et al. 2015 ; Carhart-Harris et al. 2018 ; Grob et al. 2011 ). Studi terkini telah menunjukkan bahwa psilocybin memiliki kemanjuran yang baik dalam pengobatan depresi (Carhart-Harris et al. 2018 ; Goodwin et al. 2022 ; Haikazian et al. 2023 ), dan Badan Pengawas Obat dan Makanan (FDA) telah memberikan status “Terapi Terobosan” pada psilocybin untuk pengobatan depresi yang resistan terhadap pengobatan, sehingga memudahkan pemasaran obat tersebut. Dengan persetujuan psilocybin sebagai antidepresan yang masih tertunda, metode produksi yang efisien dan berkelanjutan sangat dibutuhkan.

Sintesis biologis psilocybin merupakan alternatif yang menarik karena prosesnya yang murah dan hasil yang tinggi. Jalur biosintesis psilocybin pertama kali dilaporkan pada tahun 2017 (Skema 1 ) (Fricke et al. 2017 ). Dekarboksilasi triptofan yang dikatalisis oleh L-triptofan dekarboksilase PsiD menghasilkan triptamin. Triptamin kemudian diubah menjadi 4-hidroksitriptamin oleh enzim sitokrom P450 PsiH, yang merupakan langkah pembatas laju penting dari biosintesis psilocybin. Produksi 4-hidroksitriptamin juga dapat dicapai dengan dekarboksilasi langsung 4-hidroksitriptofan yang dikatalisis oleh PsiD (Fricke et al. 2017 ). Selanjutnya, kinase PsiK mengkatalisis fosforilasi 4-hidroksitriptamin menjadi norbaeocystin. Akhirnya, N-methyltransferase PsiM mengkatalisis metilasi norbaeocystin menjadi baeocystin, diikuti oleh metilasi lebih lanjut untuk membentuk psilocybin. Elucidasi jalur biosintesis psilocybin memfasilitasi produksinya dengan sintesis enzimatik in vitro (Fricke et al. 2019 ). Sebagai enzim P450 yang terikat membran, PsiH sulit dimurnikan. Selain itu, reaksi hidroksilasi yang dikatalisis PsiH memerlukan reduktase sitokrom P450 (CPR) untuk mentransfer dua elektron dari NADPH, membuat hidroksilasi yang dikatalisis PsiH tidak praktis dalam proses in vitro. Menggunakan 4-hidroksitriptofan sebagai substrat awal, reaksi satu pot dengan enzim PsiD/PsiK/PsiM dilakukan tanpa optimasi lebih lanjut, dan psilocybin berhasil disintesis in vitro (Fricke et al. 2017 ). Kemudian, prosedur in vitro diperluas ke substrat 4-hidroksiindol dengan memperkenalkan triptofan sintase TrpB, dan dalam reaksi satu pot dengan empat enzim, sekitar 20% dari 4-hidroksiindol yang ditambahkan diubah menjadi psilocybin (Blei et al. 2018 ). Namun, produksi dan pemurnian enzim membutuhkan banyak tenaga kerja dan waktu, dan pasokan substrat dan kofaktor mahal, sehingga produksi psilocybin secara in vitro menjadi tidak ekonomis.

Produksi heterologus senyawa bioaktif alami dalam inang mikroba telah mencapai kesuksesan besar dalam beberapa tahun terakhir (Park et al. 2020 ; Xu et al. 2020 ), karena substrat awal yang sederhana, peningkatan skala yang layak, dan hasil yang tinggi. Dengan penjelasan jalur biosintesis psilocybin, produksi heterologusnya pertama kali diimplementasikan dalam jamur berfilamen Aspergillus nidulans . Menggunakan peptida 2A dari picornavirus, gen biosintesis psilocybin diekspresikan secara polisistrofik di bawah kendali satu promotor dalam A. nidulans , dan 110 mg/L psilocybin diperoleh dengan fermentasi labu goyang (Hoefgen et al. 2018 ). Baru-baru ini, melalui represi katabolisme triptofan, strain A. nidulans yang direkayasa menghasilkan psilocybin pada titer 267 mg/L dalam kultur batch (Janevska et al. 2024 ). Saccharomyces cerevisiae juga berhasil direkayasa untuk mensintesis psilocybin, dan produksi ditingkatkan dengan melengkapi jalur tersebut dengan CPR dari P. cubensis (Milne et al. 2020 ). Setelah mengoptimalkan fermentasi fed-batch, titer psilocybin mencapai 627 ± 140 mg/L (Milne et al. 2020 ). Sebagai sasis yang banyak digunakan, Escherichia coli sering digunakan untuk produksi heterolog produk alami karena kemudahan manipulasi genetik dan kemampuannya untuk tumbuh cepat hingga kepadatan sel yang tinggi pada media yang murah. Namun, biosintesis de novo psilocybin dalam E. coli menantang karena ekspresi dan aktivitas enzim yang terikat membran rendah (Wagner et al. 2008 ), seperti enzim P450 PsiH. Untuk melewati langkah oksidasi yang dikatalisis oleh PsiH, gen triptofan sintase trpB diekspresikan bersama dengan gen psiD , psiK dan psiM (Adams et al. 2019 ). Menggunakan 4-hydroxyindole sebagai substrat, titer psilocybin mencapai 1,16 g/L melalui fermentasi feed-batch (Adams et al. 2019 ). Namun, penggunaan 4-hydroxyindole akan meningkatkan biaya produksi komersial. Untuk mengatasi keterbatasan ini, strain E. coli yang mengekspresikan gen enzim P450 psiH dimasukkan ke dalam sistem fermentasi, dan sistem ko-kultur dua strain dibangun untuk sintesis psilocybin secara de novo (Flower et al. 2023 ). Sistem ko-kultur ini mampu menghasilkan 28,5 ± 0,3 mg/L psilocybin tanpa suplementasi 4-hydroxyindole, serine, atau methionine (Flower et al. 2023)). Namun, strategi ko-kultur memiliki beberapa kekurangan, termasuk terbentuknya dua kumpulan biomassa dan keterbatasan transportasi antarsel dari zat antara yang penting, sehingga membatasi metrik produksi secara keseluruhan (Jones dan Wang 2018 ).

Di sini, kami mencapai sintesis de novo psilocybin dalam satu sel E. coli rekayasa . Dengan membangun varian PsiH yang berbeda dan mengekspresikan gen CPR dari P. cubensis , enzim P450 jamur PsiH diekspresikan secara aktif dalam E. coli . Kemudian, seluruh jalur biosintesis psilocybin berhasil disusun kembali dalam E. coli untuk mendapatkan sintesis de novo dalam satu sel. Jalur ini dioptimalkan sepenuhnya dengan mengoordinasikan suhu ekspresi enzim, meningkatkan pasokan prekursor dan kofaktor, dan merekayasa jalur transfer elektron (ET) P450. Akhirnya, galur E. coli rekayasa menghasilkan psilocybin dengan titer 79,4 mg/L dengan mengoptimalkan fermentasi shake-flask. Studi kami menyediakan rute yang berkelanjutan untuk menghasilkan psilocybin antidepresan penting dalam sel mikroba.

2 Prosedur Eksperimen
2.1 Bahan Umum
Gen dan primer disintesis oleh Tsingke Biotechnologies (Beijing, Cina). Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme) digunakan untuk amplifikasi PCR. Enzim restriksi DNA dibeli dari New England Biolabs (AS). Kit kloning dan perakitan SE seamless (Zoman) digunakan untuk perakitan DNA in vitro dan konstruksi plasmid. Asetonitril bermutu HPLC dan dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, AS). Semua bahan kimia dan pelarut lainnya bermutu analitis. Semua buffer dan larutan disiapkan dalam air Milli-Q.

2.2 Konstruksi Plasmid untuk Rekonstitusi Jalur
Untuk memperoleh enzim P450 aktif PsiH dalam E. coli , gen yang mengkode PsiH, sitokrom P450 reduktase (PcCPR) dan sitokrom b5 (PcCYB5) dari P. cubensis dioptimalkan kodon dan disintesis. Untuk meningkatkan ekspresi psiH , urutan pengkodean pengubah mirip ubikuitin kecil (SUMO) juga dioptimalkan kodon dan disintesis. Kemudian, psiH tipe liar dan berbagai varian psiH , termasuk gen yang mengkode PsiH terpotong (trPsiH), SUMO-PsiH, SUMO-trPsiH, 5144-trPsiH dan SUMO-5144-trPsiH, dibangun dan dikloning ke dalam plasmid pET28a yang dicerna Nde I dan Xho I, masing-masing, menghasilkan plasmid pHZR01–6 (Tabel S1 ). Gen PcCPR dikloning ke dalam plasmid pGro7 dan diekspresikan secara polikistronik dengan protein pendamping yang mengkode gen groES dan groEL di bawah kendali promotor araBAD , menghasilkan plasmid pHZR07. Untuk lebih meningkatkan aktivitas PsiH, gen PcCYB5 , yang mengkode protein ET kedua dari jamur P450 (Durairaj et al. 2016 ), selanjutnya dikloning ke dalam plasmid pHZR07, menghasilkan plasmid pHZR08.

Untuk mengoptimalkan langkah biosintesis pertama psilocybin, tiga gen dekarboksilase L-triptofan, termasuk psiD dari P. cubensis , BaTDC dari Bacillus atrophaeus , dan CrTDC dari Catharanthus roseus , dioptimalkan kodonnya dan disintesis. Gen-gen tersebut dikloning ke dalam plasmid pRSFDuet-GmR yang dicerna Nde I dan Xho I, yang berasal dari pRSFDuet-1 dengan mengubah gen resistensi kanamisin menjadi gen resistensi gentamisin, yang menghasilkan plasmid pHZR09–11, masing-masing.

Untuk menyusun kembali jalur biosintesis psilocybin dalam E. coli , gen psiK dan psiM dari P. cubensis dioptimalkan kodonnya dan disintesis. Gen-gen tersebut diligasikan ke dua situs kloning plasmid pRSFDuet-GmR, menghasilkan plasmid pHZR12. Gen psiD kemudian dikloning ke dalam pHZR12, menghasilkan plasmid pHZR13.

Untuk meningkatkan pasokan kofaktor NADPH untuk reaksi hidroksilasi yang dikatalisis PsiH, gen nadK dari E. coli diperkuat dan dikloning ke dalam plasmid pCDFDuet-Amp, yang berasal dari pCDFDuet-1 dengan mengubah gen resistensi streptomisin menjadi gen resisten ampisilin, menghasilkan plasmid pHZR14. Untuk meningkatkan pasokan substrat S -adenosil-L-metionina (SAM) untuk reaksi metilasi yang dikatalisis PsiM, gen metK diperkuat dari E. coli , dan gen SAM2 dari Saccharomyces cerevisiae dioptimalkan kodon dan disintesis. Mereka kemudian dikloning ke dalam plasmid pHZR14, menghasilkan plasmid pHZR15 dan pHZR16, berturut-turut. Plasmid yang telah dikonstruksi ditransformasikan ke dalam strain E. coli DH5α untuk perbanyakan dan diurutkan untuk ekspresi lebih lanjut pada strain E. coli BL21 (DE3). Semua plasmid yang dikonstruksi dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel S1 , dan primer yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel S2 ; urutan kodon yang dioptimalkan yang diekspresikan dalam penelitian ini ditunjukkan dalam Tabel S4 .

2.3 Knockout Gen Menggunakan Strategi Penyuntingan Gen yang Dimediasi CRISPR/Cas9
Strategi penyuntingan gen yang dimediasi CRISPR/Cas9 digunakan untuk melumpuhkan gen trpR dan tnaA dalam E. coli BL21. Plasmid pCas-prha-NEW untuk mengekspresikan cas9 ditransformasikan ke dalam E. coli BL21. Kemudian, 10 mM L-arabinose ditambahkan untuk induksi λ-Red, dan sel-sel kompeten elektroporasi E. coli BL21 yang mengandung pCas-prha-NEW disiapkan (Sharan et al. 2009 ). Untuk elektrotransformasi, 50 μL sel dicampur dengan 100 ng seri pTarget dan 400 ng DNA donor (fragmen yang mengandung 500 bp di hulu dan hilir gen target). Elektroporasi dilakukan dalam kuvet Gene Pulser 1 mm (Bio-Rad) pada 2,5 kV, dan produk segera disuspensikan dalam 1 mL medium LB dingin. Sel dipulihkan pada suhu 30°C selama 1 jam, dan transforman dipilih pada agar LB yang mengandung kanamisin (50 μg/mL) dan spektinomisin (50 μg/mL) semalaman pada suhu 30°C. Strain knockout selanjutnya diverifikasi dengan PCR koloni dan sekuensing DNA.

Untuk menyembuhkan seri pTarget, galur knockout yang membawa pCas-prha-NEW dan seri pTarget diinokulasi dalam 2 mL medium LB yang mengandung kanamisin (50 μg/mL) dan L-rhamnosa monohidrat (10 mM) selama 16 jam. Sel-sel tersebut kemudian diencerkan dan dipilih pada pelat LB yang mengandung kanamisin (50 μg/mL). Koloni dikonfirmasi telah sembuh dengan menentukan sensitivitasnya terhadap spektinomisin (50 μg/mL). Koloni yang sembuh dari seri pTarget digunakan dalam putaran kedua penyuntingan genom. Akhirnya, pCas-prha-NEW disembuhkan dengan menumbuhkan koloni dalam medium LB tanpa antibiotik apa pun semalaman pada suhu 37°C.

2.4 Karakterisasi Enzim Kunci melalui Biotransformasi In Vivo
Untuk memverifikasi tingkat ekspresi berbagai varian psiH , plasmid pGro7 dan masing-masing pHZR01–6 ditransformasi bersama ke dalam E. coli BL21 (DE3). Transforman dipilih pada pelat agar LB yang dilengkapi dengan 50 μg/mL kanamisin dan 25 μg/mL kloramfenikol pada suhu 37°C semalaman. Koloni kemudian dipilih dan dikultur dalam 3 mL media LB pada suhu 37°C semalaman. Sel yang diinkubasi kemudian dipindahkan ke 100 mL media LB segar (1% v/v) yang dilengkapi dengan 50 μg/mL kanamisin dan 25 μg/mL kloramfenikol. Ketika OD 600 kultur mencapai sekitar 0,4 ~ 0,6, 0,1 mM IPTG dan 500 μg/mL L-arabinosa ditambahkan untuk menginduksi ekspresi protein selama 14 jam pada suhu 20°C. 3 mL sel kemudian dikumpulkan dan disuspensikan kembali dalam 1 mL buffer Tris–HCl (50 mM, pH 7,5). Lisis sel total digunakan untuk mendeteksi ekspresi protein dengan analisis SDS-PAGE.

Untuk menguji kemampuan katalitik berbagai varian PsiH, plasmid pHZR07 dan masing-masing pHZR01–6 ditransformasi bersama menjadi E. coli BL21 (DE3), menghasilkan galur H1–6. Galur tersebut dikulturkan, dan protein diekspresikan seperti dijelaskan di atas. 50 mL sel dipanen dengan sentrifugasi. Kemudian, 1 mL medium LB segar yang dilengkapi dengan 500 μg/mL triptamin ditambahkan, dan sel-sel tersebut selanjutnya dikulturkan selama 1 hari pada suhu 20°C. Untuk memverifikasi kemampuan katalitik berbagai dekarboksilase L-triptofan, plasmid pHZR09–11 ditransformasi menjadi E. coli BL21 (DE3), menghasilkan galur D1–3. Setelah protein diekspresikan, 50 mL sel dipanen dengan sentrifugasi. Kemudian, 1 mL medium LB segar yang disuplemen dengan 500 μg/mL L-triptofan ditambahkan, dan sel-sel dikultur lebih lanjut selama 1 hari pada suhu 20°C. Untuk memverifikasi kemampuan katalitik PsiK dan PsiM, plasmid pHZR12 ditransformasi ke dalam E. coli BL21 (DE3), menghasilkan strain KM. Setelah protein diekspresikan, 50 mL sel dipanen dengan sentrifugasi. Kemudian, 800 μL produk yang ditransformasi PsiH dan 200 μL medium LB segar ditambahkan, dan sel-sel dikultur lebih lanjut selama 1 hari pada suhu 20°C. Setelah transformasi in vivo, 500 μL metanol ditambahkan ke 500 μL campuran sel. Campuran tersebut dipusarkan dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan kemudian digunakan untuk analisis HPLC.

2.5 Rekonstitusi Jalur Biosintesis Psilocybin pada E. coli
Untuk mencapai biosintesis de novo psilocybin dalam E. coli , plasmid pHZR02, pHZR07 dan pHZR13 ditransformasi bersama ke dalam E. coli BL21 (DE3), menghasilkan strain P03. Transforman dipilih pada pelat agar LB yang dilengkapi dengan 50 μg/mL kanamisin, 25 μg/mL kloramfenikol dan 40 μg/mL gentamisin pada suhu 37°C semalam. Koloni kemudian diambil dan dikultur dalam 3 mL medium LB pada suhu 37°C semalam. Selanjutnya, sel yang diinkubasi dipindahkan ke 100 mL medium LB segar (1% v/v) yang dilengkapi dengan antibiotik seperti dijelaskan di atas. Ketika OD 600 dari kultur mencapai sekitar 0,4 ~ 0,6, 0,1 mM IPTG dan 500 μg/mL L-arabinosa ditambahkan. Sel-sel tersebut selanjutnya dikultur pada suhu 20°C, 220 rpm selama 24 jam.

Untuk mendeteksi produk, 500 μL metanol ditambahkan ke 500 μL campuran sel. Campuran tersebut diaduk dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan kemudian digunakan untuk analisis HPLC. Untuk lebih meningkatkan produksi psilocybin, galur tambahan dibuat dan diuji, dan semuanya tercantum dalam Tabel 1. Semua protein yang diekspresikan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel S3 .

2.6 Optimasi Media Fermentasi
Untuk menguji apakah psilocybin dapat disintesis secara de novo pada strain P13, medium M9 yang dimodifikasi digunakan untuk fermentasi. Medium M9 yang dimodifikasi mengandung 17,4 g/L Na2HPO4 · 7H2O , 3 g /L KH2PO4 · , 1 g/L NH4Cl , 0,5 g/L NaCl, 0,49 g/L MgSO4 · 7H2O , 0,11 g/L CaCl2 , dan 20 g/L glukosa. Koloni strain P13 pada plat LB dipilih dan dikultur dalam 3 mL medium M9 pada suhu 37°C semalaman. Selanjutnya, sel yang diinkubasi dipindahkan ke 100 mL medium M9 dalam labu berpenyekat (500 mL) yang dilengkapi dengan antibiotik yang sesuai. Ketika OD 600 dari kultur mencapai sekitar 0,4 ~ 0,6, 0,1 mM IPTG dan 500 μg/mL L-arabinosa ditambahkan. Sel-sel tersebut selanjutnya dikultur pada suhu 20°C, 220 rpm selama 120 jam. Pada setiap interval 12 jam, 0,5 mL kaldu dikumpulkan dan produksi psilocybin ditentukan. Untuk lebih meningkatkan produksi psilocybin, media fermentasi yang optimal, termasuk LB segar, LBG (LB dengan glukosa 2%), dan media TB, diteliti.

2.7 Metode Analisis
Analisis kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dilakukan pada sistem Waters 2695 (AS) menggunakan kolom analitis C18 (Gemini 250 × 4,6 mm, ukuran partikel 5 μm; Phenomenex). Laju aliran fase gerak adalah 1 mL/menit, dan suhu kolom adalah 25°C. Metode analitis adalah gradien linier 5%–19% asetonitril (MeCN)-H 2 O (v/v, 0,1% asam format) selama 12 menit, diikuti oleh 100% MeCN selama 4 menit dan diseimbangkan kembali oleh 5% MeCN (v/v, 0,1% asam format) selama 6 menit. Dengan menggunakan metode ini, waktu retensi berikut diamati: norbaeocystin (5,92 menit), baeocystin (6,41 menit), psilocybin (6,75 menit), 4-hydroxytryptamine (6,95 menit), norpsilocin (7,25 menit), psilocin (7,93 menit), tryptamine (8,96 menit) dan triptofan (10,00 menit).

Untuk analisis kromatografi cair-spektrometer massa resolusi tinggi (LC-HRMS), pemisahan kromatografi cair (LC) dilakukan pada sistem seri Agilent 1260 (Agilent, AS) dengan kolom analitis C18 (Gemini 250 × 4,6 mm, ukuran partikel 5 μm; Phenomenex). Metode analitis LC sama seperti yang dijelaskan di atas. Spektrum massa dilakukan pada sistem Agilent Accurate-Mass-Q-TOF MS 6520 yang dilengkapi dengan sumber ionisasi elektrospray (ESI) dalam mode positif. Data LC-HRMS direkam dan dianalisis menggunakan perangkat lunak MassHunter Workstation (versi B.04.00, Agilent, Santa Clara, CA, AS).

Senyawa kimia psilocybin (Cayman), tryptamine (Macklin) dan tryptophan (Macklin) dibeli sebagai standar autentik, dan kurva standarnya diperoleh dengan analisis HPLC. Luas puncak jejak HPLC terekam di bawah 280 nm untuk semua senyawa. Konsentrasi standar autentik ditetapkan sebagai x, dan luas puncak jejak HPLC ditetapkan sebagai y, menghasilkan persamaan regresi (Gambar S10 ). Karena ketersediaan komersial yang terbatas dan biaya yang sangat tinggi, baeocystin, norbaeocystin dan 4-hydroxytryptamine dikuantifikasi menggunakan kurva standar analognya (Adams et al. 2019 ). Baeocystin dan norbaeocystin dikuantifikasi menggunakan kurva standar psilocybin. 4-hydroxytryptamine dikuantifikasi dari kurva standar 5-hydroxytryptamine.

3 Hasil
3.1 Konstruksi Chimeric PsiH untuk Meningkatkan Ekspresinya pada E. coli
Hidroksilasi triptamin yang dikatalisis oleh enzim P450 PsiH adalah langkah pembatas laju untuk biosintesis psilocybin dalam E. coli . Karena sifat PsiH yang terikat membran dan kebutuhan mitra redoks enzimatik untuk katalisis, sintesis de novo psilocybin dalam E. coli telah terhambat (Adams et al. 2019 ; Flower et al. 2023 ). Sebagian besar enzim P450 eukariotik memiliki daerah transmembran N-terminal yang secara alami terletak di membran retikulum endoplasma atau mitokondria (Durairaj dan Li 2022 ). Oleh karena itu, ekspresi P450 eukariotik dalam E. coli sering kali menyebabkan agregasi protein yang tidak larut (Hausjell et al. 2018 ). Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa modifikasi N-terminal dapat meningkatkan ekspresi P450 eukariotik dalam E. coli , seperti menghapus domain hidrofobik (Park et al. 2014 ) atau mengganti domain hidrofobik dengan urutan N-terminal dari P450 lainnya (Ichinose et al. 2015 ; Ichinose dan Wariishi 2013 ). PsiH memiliki daerah transmembran N-terminal dari 19 asam amino (Gambar S1 ), dan domain katalitik C-terminalnya dipisahkan dari domain hidrofobik N-terminal oleh daerah kaya prolin (PPGPP) (Gambar 1A ). Menggunakan daerah ini sebagai batas, daerah hidrofobik N-terminal dan domain fungsional katalitik C-terminal dari PsiH dipisahkan, dan beberapa protein PsiH chimeric dibangun (Gambar 1A ). Kami menghapus domain N-terminal (ditunjukkan dalam warna merah) dari PsiH tipe liar untuk menghasilkan protein PsiH terpotong (trPsiH). Kami juga mengganti domain N-terminal dari PsiH tipe liar dengan domain CYP5144C1 yang sesuai, yang telah dilaporkan meningkatkan ekspresi beberapa P450 jamur di E. coli (Ichinose et al. 2015 ), untuk membentuk protein chimeric 5144C1NTD-trPsiH. Selain itu, kami juga membangun protein chimeric SUMO-trPsiH, SUMO-5144C1NTD-trPsiH dan SUMO-PsiH (Gambar 1A ) karena pengubah kecil seperti ubiquitin (SUMO) adalah urutan tag yang banyak digunakan untuk meningkatkan ekspresi protein di E. coli (Peroutka III et al. 2011 ). Protein chimeric diekspresikan masing-masing berdasarkan jumlah salinan medium plasmid pET28a di E. coli BL21 bersama dengan chaperone molekuler GroES/GroEL, yang dapat memfasilitasi pelipatan P450 eukariotik yang tepat untuk mendapatkan enzim aktif (Ahn et al. 2004 ; Ichinose et al. 2015).). Protein yang diekspresikan dalam lisat sel total kemudian dideteksi dengan analisis SDS-PAGE. Hasilnya menunjukkan bahwa semua varian PsiH berhasil diekspresikan (Gambar 1B ), tetapi tidak dapat dimurnikan karena sifatnya yang tidak larut. Dalam hal tingkat ekspresi, semua protein chimeric memiliki tingkat ekspresi yang lebih tinggi dibandingkan dengan PsiH tipe liar (Gambar 1B , baris 2). Di antara mereka, tingkat ekspresi SUMO-5144C1NTD-trPsiH, SUMO-trPsiH dan trPsiH meningkat secara signifikan (Gambar 1B , baris 5, 7 dan 8). Hasil ini menunjukkan bahwa penghapusan domain hidrofobik N-terminal dan penambahan urutan SUMO meningkatkan ekspresi protein PsiH.

Untuk menguji kemampuan katalitik protein PsiH chimeric, gen PcCPR dari P. cubensis dikloning ke dalam plasmid pGro7 dengan nomor salinan rendah dan diekspresikan secara polikistronik dengan groEL dan groES dalam E. coli . Setelah substrat triptamin dimasukkan ke dalam galur E. coli yang direkayasa (Tabel 1 ), produk biotransformasi 4-hidroksitriptamin dideteksi dengan analisis HRMS (Gambar S2B ) dan selanjutnya dikuantifikasi dengan analisis HPLC (Gambar S2A ). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1C , semua galur menghasilkan 4-hidroksitriptamin. Di antara mereka, galur H2 yang mengekspresikan trPsiH menghasilkan titer 4-hidroksitriptamin tertinggi pada 107,82 mg/L, yang 10,53 kali lipat lebih tinggi daripada produksi 9,35 mg/L dari galur H1 yang mengekspresikan psiH tipe liar . Selain itu, galur H4 yang mengekspresikan SUMO-trPsiH dan galur H6 yang mengekspresikan SUMO-5144C1NTD-trPsiH menghasilkan 4-hidroksitriptamin pada 97,96 mg/L dan 88,97 mg/L, masing-masing 9,48 dan 8,52 kali lebih tinggi daripada galur H1. Hasil ini menunjukkan bahwa produksi 4-hidroksitriptamin berhubungan positif dengan tingkat ekspresi protein PsiH chimeric. Karena galur H2 yang mengekspresikan trPsiH menghasilkan titer 4-hidroksitriptamin tertinggi, trPsiH dipilih untuk menyusun kembali jalur biosintesis psilocybin dalam E. coli .

Kami juga menentukan efek suhu kultur pada kemampuan katalitik trPsiH. Ekspresi trPsiH diinduksi pada 18°C, 20°C, 22°C, 25°C dan 28°C, berturut-turut. Dengan memberi makan triptamin, produksi 4-hidroksitriptamin diukur dengan analisis HPLC. Hasil penelitian menunjukkan bahwa galur H2 yang dikultur pada 18°C, 20°C dan 22°C menghasilkan jumlah 4-hidroksitriptamin yang sebanding (Gambar S2C ), sedangkan produksi 4-hidroksitriptamin menurun tajam ketika galur H2 dikultur pada 25°C, yang menunjukkan bahwa trPsiH mungkin memiliki tingkat ekspresi dan efisiensi katalitik yang baik dalam kisaran 18 hingga 22°C.

3.2 Rekonstruksi Jalur Biosintesis Psilocybin pada E. coli
Setelah memperoleh PsiH chimeric dengan kinerja katalitik tinggi, kami berupaya merekonstruksi seluruh jalur biosintesis psilocybin dalam E. coli . Dekarboksilasi triptofan yang dikatalisis oleh PsiD adalah langkah pertama biosintesis psilocybin, dan pasokan prekursor triptamin yang cukup sangat penting untuk meningkatkan produksi psilocybin. Karena dekarboksilase L-triptofan BaTDC dari B. atrophaeus (Choi et al. 2021 ) dan CrTDC dari C. roseus (Noé et al. 1984 ) menunjukkan nilai Km yang relatif rendah terhadap L-triptofan dan angka turnover yang tinggi, gen pengkode mereka dioptimalkan dan disintesis bersama dengan gen psiD dari P. cubensis . Mereka dikloning ke dalam plasmid pRSFDuet-GmR dan diekspresikan dalam E. coli BL21. Dengan memberi makan triptofan, triptamin diproduksi di ketiga galur (Gambar S3A ), mengonfirmasi bahwa ketiga dekarboksilase dapat mengubah triptofan menjadi triptamin. Kami selanjutnya melakukan konversi in vivo menggunakan enzim yang diekspresikan pada suhu berbeda dalam kisaran 18°C–37°C. Kami menemukan bahwa titer triptamin dari galur yang mengekspresikan CrTDC menurun drastis dengan meningkatnya suhu, tetapi galur yang mengekspresikan psiD memberikan produksi triptamin yang relatif stabil (Gambar S3B ). Sementara itu, galur yang mengekspresikan BaTDC memberikan titer triptamin tertinggi pada 20°C, yang ditingkatkan sebesar 45,8% dibandingkan dengan galur yang mengekspresikan psiD . Oleh karena itu, BaTDC dapat menjadi kandidat pilihan untuk rekonstruksi jalur biosintesis psilocybin dalam E. coli .

Karena tingkat ekspresi psiK dan psiM sangat penting untuk efisiensi sintesis psilocybin, kami mengekspresikan gen psiM dan psiK berdasarkan plasmid pRSFDuet-GmR dengan nomor salinan tinggi dalam E. coli BL21. Dengan menambahkan supernatan yang mengandung 4-hidroksitriptamin, yang disiapkan dari strain H2 yang diberi triptamin, produk akhir psilocybin terdeteksi dibandingkan dengan kontrol negatif dan standar autentik (Gambar S4A ), yang menunjukkan bahwa PsiM dan PsiK dapat mengubah 4-hidroksitriptamin menjadi psilocybin. Kami selanjutnya mengekspresikan psiM dan psiK pada suhu yang berbeda mulai dari 18°C ​​hingga 37°C. Kami menemukan bahwa titer psilocybin meningkat seiring dengan peningkatan suhu kultur dan mencapai titer psilocybin tertinggi pada suhu 37°C (Gambar S4B ).

Suhu kultur sangat penting untuk aktivitas enzimatik dalam jalur biosintesis de novo psilocybin. Menurut pengaruh suhu kultur pada kinerja enzimatik, kami menemukan bahwa suhu rendah bermanfaat untuk PsiH dan BaTDC (Gambar S2C dan 3B ), dan suhu yang relatif tinggi bermanfaat untuk PsiK dan PsiM (Gambar S3D ). Mempertimbangkan bahwa dekarboksilasi triptofan yang dikatalisis oleh BaTDC adalah langkah pertama dan hidroksilasi triptamin yang dikatalisis oleh PsiH adalah langkah pembatas laju untuk memperoleh biosintesis de novo psilocybin dalam E. coli , kami mengekspresikan seluruh enzim biosintesis pada 20°C, yang merupakan suhu yang tepat untuk ekspresi BaTDC dan PsiH, untuk memastikan prekursor yang melimpah untuk biosintesis psilocybin. Untuk memperoleh biosintesis de novo psilocybin dalam E. coli , BaTDC , psiK dan psiM diklon ke dalam plasmid pRSFDuet-GmR dengan nomor salinan tinggi, dan plasmid pHZR13 yang dihasilkan ditransformasi bersama ke dalam E. coli BL21 bersama dengan plasmid pHZR02 dan pHZR07 (Gambar 2A ), menghasilkan galur awal P03. Galur P03 dikultur pada suhu 20°C selama 24 jam. Produk dideteksi dengan analisis HPLC. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2B , psilocybin diproduksi dibandingkan dengan kontrol negatif dan standar autentik. Analisis HRMS lebih lanjut menunjukkan bahwa perantara metilasi tidak lengkap norbaeocystin dan baeocystin tetap ada (Gambar 2B,C , Gambar S5 ). Selain itu, norpsilocin dan psilocin, produk defosforilasi spontan atau dikatalisis enzim dari baeocystin dan psilocybin (Milne et al. 2020 ), juga terdeteksi

3.3 Merekayasa Jalur Transfer Elektron untuk Meningkatkan Produksi Psilocybin
Biosintesis psilocybin yang berhasil mengindikasikan bahwa E. coli dapat dikembangkan menjadi platform yang kuat untuk karakterisasi dan rekayasa P450 eukariotik (Park et al. 2022 ). Biosintesis 4-hidroksitriptamin yang dikatalisis oleh PsiH memerlukan dua-ET dari NADPH. Titer psilocybin yang rendah dan sejumlah besar triptamin residual pada galur P03 mendorong kami untuk meningkatkan aktivitas PsiH dengan merekayasa jalur transfer elektron (ET). PsiH termasuk dalam sistem P450 kelas II jamur (Durairaj et al. 2016 ), dan jalur ET-nya terdiri dari protein terikat membran CPR yang mengandung kofaktor FAD dan FMN, yang mentransfer dua elektron dari NAD(P)H ke bagian heme (Gambar 3A ). Alternatifnya, mungkin mengandung komponen protein kecil ketiga, sitokrom b5, yang mentransfer elektron kedua ke bagian heme, dan ekspresi berlebihan CYB5 untuk meningkatkan jalur ET telah memperoleh banyak keberhasilan dalam meningkatkan produksi (Paddon et al. 2013 ; Sun et al. 2022 ; Yao et al. 2022 ). Untuk meningkatkan efisiensi ET, gen PcCYB5 dari P. cubensis diekspresikan secara polikistronik dengan PcCPR dalam P03. Galur P04 yang dihasilkan memberikan titer norbaeocystin, baeocystin dan psilocybin yang meningkat secara signifikan pada 20,4, 8,1 dan 4,1 mg/L, masing-masing, yang 5,7, 6,5 dan 4,7 kali lipat lebih tinggi daripada galur induk P03 (Gambar 3B ). Selain itu, titer triptamin pada galur P04 menurun hingga 18,6 mg/L, yang 57,6% lebih rendah daripada galur P03 (Gambar 3B ). Hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas katalitik PsiH ditingkatkan dengan memperbaiki jalur ET.
faktor redoks NAD(P)H merupakan sumber elektron penting dalam metabolisme primer dan sekunder seluler dan sangat diperlukan untuk siklus katalitik P450 jamur. Kekurangan NAD(P)H dapat mengurangi aktivitas P450 karena transfer elektron yang tidak efisien. Meningkatkan kadar NADPH seluler dapat meningkatkan produksi biosintesis yang melibatkan P450 (Liu et al. 2021 ). Dengan demikian, kami mengubah rute metabolisme redoks untuk meningkatkan aktivitas PsiH. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekspresi berlebih dari gen kinase NAD+ ( nadK ) pada E. coli meningkatkan pasokan NADPH, yang selanjutnya menyebabkan produksi isobutanol bakteri (Shi et al. 2013 ). Oleh karena itu, kami mengekspresikan berlebihan gen nadK asli pada plasmid pCDFDuet-Amp pada galur P04. Galur P05 yang dihasilkan memberikan titer norbaeocystin, baeocystin dan psilocybin yang meningkat masing-masing sebesar 48,6, 11,5 dan 9,5 mg/L, yang masing-masing meningkat sebesar 134%, 42% dan 132% dibandingkan dengan strain induknya P04 (Gambar 3B ), menunjukkan bahwa aktivitas katalitik PsiH ditingkatkan dengan meningkatkan pasokan NADPH.

3.4 Meningkatkan Akumulasi Triptofan untuk Meningkatkan Produksi Psilocybin
Pasokan prekursor yang memadai sangat penting untuk biosintesis senyawa target (Sang et al. 2023 ). Karena triptofan adalah prekursor awal untuk biosintesis psilocybin, peningkatan akumulasi triptofan akan meningkatkan produksi psilocybin. Jalur biosintesis triptofan telah dipelajari secara ekstensif, dan ada sejumlah laporan yang menjelaskan modifikasi untuk meningkatkan pasokan triptofan (Ren et al. 2023 ). Triptofanase (TnaA) mengkatalisis konversi triptofan menjadi indol (Gambar 4A ), jadi melumpuhkan gen tnaA akan memblokir aliran metabolisme ke indol dan dengan demikian meningkatkan akumulasi triptofan (Lee et al. 2020 ). Kami memperoleh mutan gangguan tnaA dari E. coli BL21 dengan menggunakan alat penyuntingan gen yang dimediasi CRISPR/Cas9 (Gambar S6 ) seperti yang dijelaskan sebelumnya (Jiang et al. 2015 ) dan menamainya galur P01. Kemudian, PcCYB5 , nadK dan gen biosintetik psilocybin diekspresikan dalam galur P01, menghasilkan galur P06. Titer triptamin, norbaeocystin, baeocystin dan psilocybin adalah 30,4, 95,4, 11,6 dan 11,1 mg/L, yang ditingkatkan masing-masing sebesar 27%, 96%, 0% dan 17%, dibandingkan dengan galur P05 (Gambar 3B ), menunjukkan bahwa pemblokiran degradasi triptofan dapat meningkatkan produksi norbaeocystin secara signifikan. Tetapi produksi baeocystin dan psilocybin hampir tidak membaik, yang menunjukkan bahwa metilasi adalah langkah pembatas laju. Kami selanjutnya menghilangkan penghambatan umpan balik biosintesis triptofan pada galur P01 dengan melumpuhkan represor transkripsi yang mengkode gen trpR (Gambar 4A , Gambar S6 ), menghasilkan galur P02. Dengan mengekspresikan bersama PcCYB5 , nadK dan gen biosintesis psilocybin pada galur P02, galur P07 yang dihasilkan menghasilkan triptamin, norbaeocystin, baeocystin dan psilocybin pada titer 32,3, 105,3, 13,9 dan 14,0 mg/L, yang mewakili peningkatan masing-masing sebesar 6,3%, 10,1%, 19,8% dan 26,1%, dibandingkan galur P06.

3.5 Meningkatkan Metilasi untuk Meningkatkan Produksi Psilocybin
Psilocybin adalah senyawa dimetilasi, dan S -adenosil-L-metionina (SAM) bertindak sebagai donor metil utama (Gambar 5A ). Pada galur P07, titer total norbaeocystin dan baeocystin, yang merupakan komponen utama produk, adalah 119,2 mg/L. Dua kemungkinan alasannya adalah: (i) kurangnya suplementasi SAM untuk metilasi yang melibatkan PsiM; (ii) kemampuan katalitik metiltransferase PsiM yang tidak mencukupi. Untuk menguji apakah pasokan donor metil merupakan faktor pembatas untuk sintesis psilocybin (Kunjapur et al. 2016 ; Shen et al. 2022 ), 0,5 mg/mL metionina (Met) dimasukkan ke dalam kultur galur P07. Hasilnya menunjukkan bahwa strain P07 menghasilkan 11,9 mg/L psilocybin (Gambar S7 ), yang lebih rendah daripada kelompok kontrol. Kami selanjutnya mengaktifkan siklus SAM dengan mengekspresikan gen metionina adenosiltransferase secara berlebihan untuk meregenerasi SAM. Pertama-tama kami mengekspresikan gen metK asli secara berlebihan (Liu et al. 2022 ) pada strain P07 pada plasmid pCDFDuet-Amp, tetapi strain P08 yang dihasilkan menunjukkan penurunan produksi baeocystin dan psilocybin (Gambar 5B ). Ketika metK digantikan oleh gen SAM2 (Liu et al. 2022 ) dari S. cerevisiae (strain P09), kami menemukan hasil yang serupa (Gambar 5B ). Hasil ini menunjukkan bahwa pasokan SAM bukanlah faktor pembatas untuk efisiensi katalitik PsiM.

Karena PsiM adalah satu-satunya enzim yang mengkatalisis reaksi metilasi berturut-turut untuk mengubah norbaeocystin menjadi produk akhir, aktivitas katalitiknya sangat penting untuk produksi psilocybin. Untuk memperoleh enzim PsiM dengan aktivitas katalitik yang lebih tinggi, cDNA PacPsiM dari Panaelus cyanescens , GdPsiM dari Gymnopilus dilepis , dan PscPsiM dari Psilocybe cyanescens (Gambar S8 ) dioptimalkan kodon dan disintesis untuk menggantikan PcPsiM pada galur P07 untuk menghasilkan galur P10–12 (Tabel 1 ). Namun, tidak ada galur yang menghasilkan titer psilocybin yang lebih tinggi daripada galur P07 (Gambar S9 ), yang menunjukkan bahwa PcPsiM dari P. cubensis adalah alel optimal pada E. coli .

Kami selanjutnya meningkatkan salinan tambahan PcPsiM pada plasmid pHZR02 menggunakan kerangka ekspresi T7 independen setelah gen psiH . Plasmid pHZR20 yang dihasilkan ditransformasi bersama ke dalam galur P02 dengan plasmid pHZR08, pHZR13, dan pHZR14 untuk menghasilkan galur P13. Galur P13 menunjukkan titer psilocybin yang meningkat secara nyata sebesar 33,8 mg/L dalam fermentasi labu, yang 1,4 kali lebih tinggi daripada galur P07. Titer norbaeocystin yang tidak termetilasi adalah 8,1 mg/L, yang 92,3% lebih rendah daripada galur P07, yang menunjukkan bahwa peningkatan jumlah salinan gen psiM dapat sangat meningkatkan langkah pertama metilasi. Namun, produk metilasi satu langkah baeocystin dalam jumlah berlebihan (36,0 mg/L) terakumulasi, menunjukkan bahwa putaran kedua transfer metil masih tidak efisien, yang mungkin disebabkan oleh efisiensi katalitik PsiM yang lebih tinggi terhadap norbaeocystin daripada baeocystin (Hudspeth dan Rogge 2024 ).

3.6 Optimasi Media Fermentasi
Untuk menguji kemampuan strain rekayasa dalam mensintesis psilocybin secara de novo, medium M9 yang dimodifikasi digunakan untuk fermentasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa psilocybin mencapai titer maksimumnya sebesar 9,4 mg/L pada 72 jam, yang menunjukkan bahwa psilocybin disintesis secara de novo pada strain P13. Namun, produksinya lebih rendah dibandingkan dengan strategi kultur bersama E. coli sebelumnya (Flower et al. 2023 ), yang mungkin disebabkan oleh pertumbuhan strain P13 yang buruk pada medium M9. Untuk mengoptimalkan kondisi kultur guna meningkatkan produksi psilocybin, strain P13 dikultur dalam media fermentasi yang berbeda. Strain P13 dikenakan 100 mL medium LB, LBG dan TB, masing-masing, dan dikultur dalam labu fermentasi bersekat 500 mL. Hasilnya menunjukkan bahwa psilocybin mencapai titer maksimum 29,9 mg/L pada 24 jam dalam medium LB, 79,4 mg/L pada 48 jam dalam medium TB dan 75,7 mg/L pada 72 jam dalam medium LBG, masing-masing (Gambar 5C ). Produksi psilocybin tertinggi dalam medium TB meningkat sebesar 232,2% dibandingkan dengan medium LB dan merupakan peningkatan 100 kali lipat dibandingkan strain awal P03. Medium LBG juga menghasilkan titer psilocybin yang tinggi, tetapi membutuhkan waktu kultur yang lebih lama daripada medium TB (Gambar 5C ), yang mungkin disebabkan oleh fakta bahwa E. coli mengonsumsi glukosa untuk pertumbuhan yang cepat ketika medium LBG digunakan, dan akumulasi asam asetat menghambat sintesis produk sampai glukosa habis (Lee 1996 ). Sementara sumber karbon TB adalah gliserol, E. coli mengonsumsi gliserol dengan kecepatan lambat, sehingga mengakibatkan penurunan fluks karbon yang masuk ke dalam fermentasi dan berkurangnya akumulasi asam asetat (Lee dan Chang 1990 ). Oleh karena itu, hasil kami menunjukkan bahwa media TB cocok untuk produksi psilocybin dalam fermentasi labu.

4 Diskusi
Dalam studi ini, biosintesis de novo psilocybin berhasil dicapai dalam satu inang E. coli . Karena sifat enzim P450 PsiH yang terikat membran dan perlunya mitra redoks enzimatik untuk katalisis, sintesis de novo psilocybin dalam E. coli telah terhambat (Adams et al. 2019 ; Flower et al. 2023 ). Domain N-terminal dari sebagian besar enzim sitokrom P450 eukariotik mengandung daerah penahan membran yang secara intrinsik tertanam dalam retikulum endoplasma atau struktur membran mitokondria (Durairaj dan Li 2022 ). Hal ini sering menyebabkan pembentukan agregat protein tak larut yang substansial, yang secara signifikan menghambat ekspresinya dalam E. coli (Hausjell et al. 2018 ). Dengan demikian, kami mengekspresikan PsiH bersama dengan protein chaperone molekuler seperti GroES/GroEL, yang dapat memfasilitasi pelipatan P450 eukariotik yang tepat untuk memperoleh enzim aktif (Ahn et al. 2004 ; Ichinose et al. 2015 ). Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa modifikasi N-terminal dapat meningkatkan ekspresi P450 eukariotik dalam E. coli , seperti menghapus domain hidrofobik (Park et al. 2014 ) atau mengganti domain hidrofobik dengan urutan N-terminal P450 lainnya (Ichinose et al. 2015 ; Ichinose dan Wariishi 2013 ). Dalam penelitian ini, banyak varian PsiH dengan modifikasi domain hidrofobik N-terminal telah dibangun (Gambar 1A ). Kami menemukan bahwa menghapus domain hidrofobik N-terminal dari PsiH jelas dapat meningkatkan tingkat ekspresinya (Gambar 1B ), seperti varian trPsiH, SUMO-trPsiH dan SUMO-5144C1NTD-trPsiH. Dengan mengekspresikan bersama mitra redoks PcCPR dari P. cubensis , semua varian PsiH yang dikonstruksi menunjukkan aktivitas hidroksilase triptamin, dan produksi 4-hidroksitriptamin berhubungan positif dengan tingkat ekspresi protein PsiH kimerik, terutama karena galur H2 yang mengekspresikan trPsiH menghasilkan titer 4-hidroksitriptamin tertinggi pada 107,82 mg/L, yang 10,53 kali lipat lebih tinggi daripada galur H1 yang mengekspresikan psiH tipe liar (Gambar 1C ). PsiH yang direkayasa menunjukkan aktivitas katalitik yang lebih baik. Menggunakan trPsiH bioaktif, seluruh jalur biosintesis psilocybin berhasil disusun kembali, dan psilocybin disintesis secara de novo dalam E. coli .

Karena hidroksilasi yang dikatalisis oleh PsiH merupakan langkah pembatas laju dalam biosintesis psilocybin, aktivitas PsiH sangat penting untuk produksi yang tinggi. Selain modifikasi N-terminus dari PsiH, kami juga merekayasa jalur ET-nya untuk meningkatkan aktivitas katalitik PsiH. CPR secara berurutan mentransfer dua elektron dari NAD(P)H untuk mengaktifkan oksigen molekuler dalam reaksi yang dimediasi oleh P450 dan memainkan peran penting dalam jalur ET (Durairaj et al. 2016 ; Durairaj dan Li 2022 ). Bahasa Indonesia: Selain CPR, komponen protein ketiga, CYB5, dapat membantu dalam ET kedua (Durairaj et al. 2016 ; Durairaj dan Li 2022 ), dan ekspresi berlebihan CYB5 untuk meningkatkan jalur ET telah memperoleh banyak keberhasilan dalam karya-karya lain (Paddon et al. 2013 ; Sun et al. 2022 ; Yao et al. 2022 ). Dengan mengekspresikan berlebihan PcCYB5, titer psilocybin dalam galur P04 sangat ditingkatkan sebesar 4,7 kali lipat dibandingkan dengan galur induk P03. Kami kemudian meningkatkan efisiensi jalur ET dengan meningkatkan pasokan NADPH, yang selanjutnya meningkatkan produksi psilocybin sebesar 132%.

Untuk memperoleh biosintesis de novo psilocybin dalam satu sel, enzim-enzim biosintesis harus diekspresikan dalam kondisi yang sesuai, khususnya suhu ekspresi. PsiH dan BaTDC menunjukkan aktivitas konversi terbaiknya pada suhu 20°C (Gambar S2C dan S3B ), dan aktivitas katalitik PsiH menurun tajam ketika suhu ekspresi lebih tinggi dari 25°C, sementara PsiK dan PsiM memberikan peningkatan titer psilocybin dengan peningkatan suhu kultur dari 18°C ​​ke 37°C (Gambar S4B ). Karena BaTDC dan PsiH mengkatalisis proses awal biosintesis psilocybin, kami mengekspresikan seluruh enzim biosintesis pada suhu 20°C untuk memastikan prekursor yang melimpah untuk biosintesis psilocybin. Berdasarkan suhu ini, psilocybin berhasil disintesis secara de novo dalam E. coli . Akhirnya, dengan mengoptimalkan kondisi fermentasi labu, 79,4 mg/L psilocybin diproduksi dalam media TB tanpa penambahan substrat seperti 4-hydroxyindole, serine, dan metionina.

Bahasa Indonesia: Untuk menyusun kembali jalur biosintesis psilocybin secara efisien dalam E. coli , gen-gen biosintesisnya diekspresikan secara hati-hati menggunakan plasmid dengan nomor salinan yang berbeda, karena produksi psilocybin sensitif terhadap tingkat ekspresi gen jalur (Adams et al. 2019 ). Pertama, gen kunci psiH diekspresikan berdasarkan plasmid pET28a dengan nomor salinan sedang untuk memastikan PsiH yang cukup untuk katalisis pada langkah pembatasan laju dan untuk mencegah akumulasi inklusi PsiH yang berlebihan untuk efek penghambatannya pada pertumbuhan sel. Kedua, protein jalur ET diekspresikan berdasarkan plasmid pGro7 dengan nomor salinan rendah. Jalur ET sangat penting untuk kemampuan katalitik P450 eukariotik, tetapi CPR dan CYB5 keduanya adalah protein terikat membran yang akan menyebabkan stres retikulum endoplasma (ER) yang parah ketika diekspresikan secara berlebihan dalam sel (Hu et al. 2022 ). Umumnya, hanya ada satu atau dua gen CPR dalam genom jamur yang dapat mengoordinasikan banyak P450 (Durairaj et al. 2016 ), dan rasio P450:CPR yang tinggi bermanfaat untuk meningkatkan aktivitas katalitik P450 (Sun et al. 2023 ). Dengan demikian, ekspresi gen PcCPR dan PcCYB5 berdasarkan plasmid pGro7 dengan nomor salinan rendah sangat meningkatkan produksi psilocybin (Gambar 3 ). Ketiga, dan yang paling penting, gen BaTDC , psiK dan psiM diekspresikan berdasarkan plasmid pRSFDuet dengan nomor salinan tinggi, yang menghasilkan produksi psilocybin yang tinggi pada strain rekayasa.

Psilocybin memiliki dua gugus metil yang ditransfer dari SAM yang dikatalisis oleh metiltransferase PsiM (Gambar 5A ). Akumulasi norbaeocystin dan baeocystin pada strain P07 (Gambar 4B ) mengindikasikan bahwa langkah metilasi terganggu. Peningkatan pasokan SAM dengan menambahkan metionina dalam kultur (Gambar S7 ), atau ekspresi berlebihan gen metionina adenosiltransferase yang berbeda tidak meningkatkan produksi psilocybin (Gambar 5B ), yang mengindikasikan bahwa SAM bukanlah faktor pembatas untuk aktivitas katalitik PsiM. Peningkatan ekspresi PsiM dengan menambahkan salinan ekstra gen psiM meningkatkan produksi psilocybin pada galur P13 sebanyak 1,4 kali lipat dan menurunkan akumulasi zat antara norbaeocystin yang tidak termetilasi sebanyak 92,3% (Gambar 5B ), yang menunjukkan bahwa langkah metilasi pertama sangat ditingkatkan, yang selanjutnya meningkatkan produksi psilocybin (Milne et al. 2020 ). Namun, sejumlah besar baeocystin terakumulasi pada galur P13, yang mungkin disebabkan oleh afinitas PsiM yang lebih rendah untuk baeocystin dibandingkan dengan norbaeocystin, dan nilai Kcat dua kali lipat dari transfer metil pertama dibandingkan dengan reaksi metilasi kedua (Hudspeth dan Rogge 2024 ). Dengan demikian, untuk lebih meningkatkan produksi psilocybin, diperlukan lebih banyak upaya untuk rekayasa PsiM guna meningkatkan efisiensi reaksi metilasi kedua.

5. Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, kami telah membuat platform berbasis E. coli yang mampu memproduksi psilocybin secara de novo tanpa pemberian prekursor apa pun. P450 eukariotik secara umum dianggap berkinerja buruk pada sel prokariotik, tetapi melalui modifikasi N-terminus dan optimalisasi jalur ET, pekerjaan kami memberikan contoh yang sangat baik tentang rekayasa P450 eukariotik untuk mencapai efisiensi katalitik yang lebih tinggi dan mensintesis produk-produk berharga alami pada inang prokariotik. Dikombinasikan dengan strategi rekayasa pasokan prekursor dan peningkatan reaksi metilasi akhir, psilocybin secara efektif disintesis secara de novo dalam satu sel E. coli untuk pertama kalinya. Pekerjaan kami menunjukkan produksi psilocybin lengkap pada inang prokariotik dan menyediakan rute yang berkelanjutan bagi psilocybin untuk memenuhi produksi industri dan aplikasi farmasi.