ABSTRAK
Studi ini menyelidiki sifat antibakteri dari asam polilaktat (PLA)/kitosan: film pati yang digabungkan dengan minyak esensial jeruk pahit (BOEO) untuk mengawetkan fillet ikan trout pelangi. Tiga konsentrasi BOEO (0,7%, 1,4%, dan 2,1% b/b) digabungkan melalui pengecoran. Peningkatan konsentrasi BOEO meningkatkan sifat hidrofobisitas dan ketahanan termal film, tetapi mengurangi kekuatan tarik sambil meningkatkan perpanjangan. Mikroskopi gaya atom mengungkapkan kekasaran permukaan yang berubah. Pengujian antibakteri menunjukkan aktivitas optimal terhadap bakteri Gram-positif dan Gram-negatif pada 1,2% BOEO. Film yang mengandung 1,2% BOEO diaplikasikan pada fillet ikan trout pelangi, secara signifikan mengurangi bakteri pembusuk (jumlah bakteri total, psikrotrofik, bakteri asam laktat, dan Enterobacteriaceae), memperlambat pembusukan kimia (nilai pH dan TBA), dan meminimalkan kehilangan berat selama 16 hari penyimpanan berpendingin (4 °C). Hasil-hasil ini menunjukkan potensi film pati PLA/kitosan yang dipadukan dengan BOEO untuk memperpanjang masa simpan ikan trout pelangi.

1 Pendahuluan
Konsumen dalam industri makanan memiliki permintaan yang tinggi terhadap produk daging segar, yang umumnya diterima dengan baik (Nasution et al. 2023 ). Namun, umur simpan yang pendek dari produk-produk ini menjadi perhatian bagi perusahaan-perusahaan makanan. Ikan, seperti Oncorhynchus mykiss , sebagai sumber protein yang berharga, memiliki kemampuan untuk menyediakan sebagian besar protein yang dibutuhkan oleh manusia karena berbagai spesies yang tersedia (Naghdi et al. 2023 ). Produk-produk makanan laut dengan cepat kehilangan kualitasnya karena berbagai perubahan kimia, enzimatik, dan fisik yang secara langsung mempengaruhi empat kategori utama senyawa dalam produk-produk ini: protein, lemak, karbohidrat, dan kelembaban (Far et al. 2023 ). Perubahan-perubahan ini meliputi perubahan dalam asam amino, enzim, dan basa nitrogen seperti amonia dan TMAO (Far et al. 2023 ). Perubahan dalam rasa dan aroma produk-produk makanan laut terjadi dengan cepat karena reaksi oksidasi dan kontaminasi dengan mikroorganisme. Meningkatkan metode penyimpanan dapat meningkatkan kualitas dan umur simpan produk ini, sehingga mencegah ketidakpuasan pelanggan dan kerugian pasar (Kumar et al. 2023 ).

Kemasan memainkan peran penting dalam pengawetan dan pemasaran produk makanan. Kemasan berfungsi sebagai titik kontak pertama antara konsumen dan produk, yang memengaruhi kualitas barang yang dipersepsikan (Zeid et al. 2019 ). Teknologi pengemasan baru sedang dikembangkan untuk memenuhi permintaan konsumen akan produk yang segar dan lezat dengan masa simpan yang panjang dan kualitas yang terkendali (Zeid et al. 2019 ). Perubahan dalam perilaku konsumen dan praktik ritel menimbulkan tantangan yang signifikan bagi industri pengemasan makanan, yang mendorong pengembangan konsep pengemasan yang inovatif untuk meningkatkan pengawetan, kontrol kualitas, dan keamanan pangan (Sreekanth et al. 2024 ). Penggunaan kemasan berbasis minyak bumi telah menimbulkan masalah lingkungan yang cukup besar di kalangan konsumen (Sreekanth et al. 2024 ). Akibatnya, dalam beberapa tahun terakhir, baik industri maupun konsumen telah beralih ke arah produksi dan pemanfaatan polimer yang dapat terurai secara hayati sebagai solusi alternatif (Wang et al. 2022 ). Polimer biodegradable adalah polimer yang dapat didegradasi dalam kondisi aerobik dan anaerobik, berubah menjadi material yang mampu kembali ke tanah (Kumar et al. 2023 ). Biopolimer dapat diklasifikasikan berdasarkan asal-usulnya ke dalam kategori berbasis hewan, berbasis tumbuhan, polimer yang berasal dari mikroorganisme, lipid (berbasis hewan dan tumbuhan), polisakarida (seperti selulosa, pati, dan kitin), protein (seperti zein jagung, gluten gandum, dan protein kedelai), dan monomer alami (Zhang et al. 2021 ). Saat ini, polimer biodegradable yang bersumber dari sumber terbarukan seperti pati dan kitosan membantu melestarikan sumber daya alam, ramah lingkungan, dapat didaur ulang, dan telah menarik perhatian signifikan dari para peneliti (Zhang et al. 2021 ). Mereka memiliki potensi besar dalam aplikasi pengemasan. Selain itu, asam polilaktat (PLA) dikenal sebagai polimer yang dapat diurai secara hayati, dapat dicetak dengan panas, dan terbarukan, yang menawarkan banyak keuntungan termasuk penghematan energi yang signifikan, kemampuan untuk mendaur ulang asam laktat melalui hidrolisis atau alkoholisis, potensi untuk memproduksi kemasan komposit kertas-plastik yang dapat dijadikan kompos, pengurangan volume limbah, manfaat pertanian, dan kemampuan untuk memodifikasi sifat fisiknya (Wang et al. 2022 ). Kemasan aktif, sebuah konsep baru dalam kemasan makanan, menanggapi kebutuhan konsumen yang terus berkembang dan tren pasar dengan menggabungkan perubahan kimia atau biologis dalam kemasan untuk meningkatkan keamanan pangan dan umur simpan (Chen et al. 2024 ). Penggunaan kemasan aktif dapat menawarkan manfaat praktis dalam pengawetan makanan. Kemasan antimikroba dengan pelepasan senyawa antimikroba secara bertahap atau terkendali ke dalam makanan membantu mencegah pembusukannya (Zeid et al. 2019).). Umumnya, agen antimikroba yang digunakan dalam AFCM terdiri dari senyawa organik, mineral, dan bioaktif, dengan preferensi untuk agen antimikroba alami dan tidak beracun yang diketahui karena masalah lingkungan dan kesehatan (Kamkar et al. 2021 ; Song et al. 2022 ). Minyak esensial berbasis tanaman secara efektif membunuh banyak mikroba berbahaya dan dianggap aman untuk digunakan sebagai Umumnya Diakui Aman (GRAS) oleh FDA. Di antara berbagai minyak esensial, minyak esensial jeruk pahit yang diekstrak dari tanaman Citrus aurantium terkenal karena sifat antimikroba dan antioksidannya (Gaff et al. 2020 ). Aktivitas ini terutama dikaitkan dengan dua gugus fenolik, karvakrol dan timol, dan hidrokarbon monoterpena p-cymene dan γ-terpinene (yang terdapat dalam konsentrasi yang lebih rendah) (Gaff et al. 2020 ; Mejri et al. 2024 ). Minyak esensial jeruk pahit dianggap sebagai kandidat yang menjanjikan untuk mengembangkan agen antimikroba dalam makanan karena kinerjanya yang efektif melawan bakteri Gram positif dan Gram negatif yang berbahaya (Mejri et al. 2024 ).

Oleh karena itu, tahap pertama dari penelitian ini difokuskan pada pembuatan sistem komposit dua lapis dari pati: kitosan/PLA. Berdasarkan informasi yang diberikan, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyiapkan lapisan film dua lapis berdasarkan pati: kitosan/asam polilaktat yang mengandung minyak atsiri jeruk pahit. Kemudian, lapisan film ini digunakan untuk menyimpan fillet ikan trout pelangi di lemari es.

2 Bahan dan Metode
2.1 Persiapan Film PLA
Tahapan penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pengolahan Universitas Tarbiat Modares. Film PLA (dibeli dari Sigma) disiapkan menggunakan metode pencetakan. Awalnya, butiran asam polilaktat dikeringkan selama 3 jam dalam oven pada suhu 105°C. Selanjutnya, setelah didinginkan dalam desikator, larutan PLA dalam kloroform dengan perbandingan berat terhadap berat (b/b) 5:1 ditempatkan pada pengaduk magnetik (kecepatan 400 rpm) pada suhu 25°C selama 1 jam. Larutan polimer kemudian dituang ke dalam cawan Petri dan dibiarkan kering pada suhu kamar selama 3 hari. Setelah kering, film dipisahkan dengan hati-hati dari wadah dan disegel dalam kantong plastik sebelum dianalisis (Jamshidian et al. 2010 ).

2.2 Persiapan Film Chitosan/Pati
Untuk menghasilkan film kitosan/pati dua lapis, larutan kitosan 2% dan pati 3% (dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, AS)) pertama-tama disiapkan. Untuk persiapan larutan kitosan, 2 g bubuk kitosan dilarutkan dalam 100 mL asam asetat 1% yang telah disiapkan sebelumnya, dan larutan tersebut diletakkan pada pengaduk magnetik pada suhu kamar selama 24 jam. Selanjutnya, larutan kitosan yang disiapkan dipindahkan ke tabung Falcon dan disentrifugasi pada 9000 rpm selama 20 menit (Fan et al. 2023 ; Istiqomah et al. 2022 ). Selanjutnya, untuk persiapan larutan pati, 3 g bubuk pati dilarutkan dalam 100 mL air suling pada suhu 80°C selama 24 jam pada pengaduk magnetik. Kemudian, larutan kitosan dan pati yang telah disiapkan dicampur dalam rasio volume-ke-volume yang ditentukan menurut Tabel 1 untuk membentuk larutan film dua lapis. Gliserol (0,3 g/g bahan kering) ditambahkan ke larutan pembentuk film dan diaduk selama 15 menit tambahan pada suhu 45°C. Selanjutnya, untuk menghilangkan gelembung dalam matriks polimer, proses penghilangan gelembung dilakukan selama 15 menit. Akhirnya, sejumlah larutan yang telah disiapkan dituangkan ke dalam wadah plastik dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 45°C selama 48 jam untuk membentuk film komposit. Setelah kering, film dipisahkan dengan hati-hati dari wadah dan disegel dalam kantong plastik untuk penyimpanan dan pengujian lebih lanjut.

TABEL 1. Komposisi film pati/kitosan dua bagian.

2.3 Pembuatan Film Dua Lapisan Berbasis PLA-Pati/Kitosan Mengandung Minyak Atsiri Jeruk Pahit
Volume spesifik dari film pembentuk dua lapis pati/kitosan yang dioptimalkan (perlakuan 25/75% pati/kitosan), seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2 , dituangkan ke lapisan pertama (film PLA kering) dan ditempatkan dalam oven pada suhu 45°C selama 24 jam untuk pengeringan. Setelah pengeringan, film dipisahkan dengan hati-hati dari wadah dan disegel dalam kantong plastik untuk penyimpanan dan pengujian lebih lanjut. Selain itu, untuk menyiapkan film dua lapis yang mengandung jeruk pahit, setelah melakukan uji fisik/mekanis dan memilih rasio optimal PLA-pati/kitosan, larutan pembentuk film dua lapis yang mengandung jeruk pahit pada tiga level (BOEO) (0,7%, 0,4%, 0,2%) yang disiapkan sebelumnya dituangkan ke lapisan pertama (film PLA kering) dalam rasio tertentu terhadap larutan PLA dan dikeringkan dalam oven pada suhu 45°C selama 24 jam.

TABEL 2. Komposisi film dua lapis berdasarkan PLA dan komposit pati-kitosan yang mengandung minyak esensial jeruk pahit.

2.4 Karakterisasi Film yang Disiapkan
2.4.1 Pengukuran Ketebalan Film dan Sudut Kontak Film
Menggunakan mikrometer digital (akurasi 0,01 mm), ketebalan setiap sampel diukur di tujuh titik. Ketebalan rata-rata menentukan kekuatan tarik dan permeabilitas uap air. Untuk mengukur sudut kontak film, metode tetes Sessile digunakan. Untuk tujuan ini, 5 μL air suling ganda ditempatkan pada sampel dengan perangkat, dan sudut kontak tetesan dengan film dilaporkan pada waktu awal (Javidi et al. 2016 ).

2.4.2 Penentuan Sifat Mekanik Film
Untuk menilai sifat mekanis film, faktor-faktor seperti kekuatan tarik (TS) dalam MPa, persen perpanjangan putus (EAB), dan modulus elastisitas (EM) dalam GPa diukur menurut standar ASTM D88-02 (ASTM, 2002). Awalnya, sampel diseimbangkan pada kelembaban 55% dalam desikator yang berisi magnesium nitrat selama 48 jam. Selanjutnya, tiga sampel dari setiap perlakuan, berukuran 10 × 2 cm, dipotong dan ditempatkan di antara rahang mesin dengan jarak awal 3 cm dan kecepatan rahang atas 50 mm/menit. Nilai tegangan dan regangan kemudian dihitung dari grafik dan tabel yang diperoleh.

2.4.3 Permeabilitas Uap Air pada Film
Pengujian ini dilakukan menurut metode standar ASTM E96/E96M-05. Selama pengujian ini, film yang dihasilkan disegel dengan minyak silikon ke dalam gelas kaca berdiameter 49 mm yang berisi 6 mL air suling (kelembapan relatif 100%). Gelas-gelas tersebut kemudian ditempatkan di dalam desikator yang berisi gel silika (kelembapan relatif sekitar 0%) pada suhu ruangan dan dibiarkan agar film mencapai kesetimbangan selama 2 jam sebelum menimbang gelas-gelas tersebut. Selanjutnya, gelas-gelas tersebut ditimbang setiap 2 jam selama periode 10 jam (Sarhadi et al. 2024 ).

2.4.4 Penyerapan Air pada Film
Penyerapan air pada film diukur menggunakan metode yang dijelaskan oleh Sreekanth et al. ( 2024 ) pada suhu 25°C ± 2°C selama periode 6 minggu. Awalnya, sampel film ditimbang menggunakan neraca digital dengan akurasi 0,0001 g, dan berat kering awalnya dihitung. Sampel kemudian ditempatkan dalam oven pada suhu 105°C dan ditimbang kembali. Selanjutnya, sampel film ditempatkan dalam wadah tertutup berisi 30 mL air suling. Setelah setiap periode 7 hari, sampel dikeluarkan dari wadah untuk mengeringkan kelebihan air menggunakan kertas isap, dan kemudian ditimbang kembali sebelum dikembalikan ke wadah dengan air suling. Penyerapan air pada film dari waktu ke waktu dihitung sebagai rata-rata dari tiga pengulangan menggunakan rumus:

2.4.5 Jumlah Kehilangan Berat Film
Kehilangan berat, ditentukan menurut Erdohan et al. ( 2013 ), dihitung sebagai persentase penurunan berat film setelah mengeringkan potongan kecil pada suhu 105°C selama 24 jam.

2.4.6 Pengukuran Warna Permukaan, Kekeruhan, dan Jumlah Cahaya yang Melewati Film
Warna permukaan, dinyatakan sebagai nilai L, a, dan b, ditentukan menggunakan ubin putih standar ( L * = 63,94, a * = 0, b * = 65,0) sebagai latar belakang (Park et al. 2022 ). Faktor a* dan b* masing -masing mewakili sumbu merah-hijau dan kuning-biru (Gambar 1-3 ). Perbedaan warna sampel dibandingkan menggunakan faktor ΔE .

2.5 Mikroskop Elektron Pemindaian (SEM) Film
Untuk menguji efek penambahan minyak atsiri jeruk pahit pada struktur mikro film yang dihasilkan, gambar permukaan dan penampang film disiapkan. Untuk tujuan ini, potongan film yang sudah kering ditempelkan pada dudukan aluminium menggunakan perekat dua sisi. Selanjutnya, untuk meningkatkan konduktivitas, lapisan tipis emas disemprotkan ke film, lalu film tersebut ditempatkan di dalam mikroskop elektron pemindaian. Terakhir, pencitraan sampel dilakukan pada berbagai perbesaran untuk menganalisis struktur mikro film (Kamkar et al. 2021 ).

2.6 Mikroskopi Gaya Atom (AFM) pada Film
Uji mikroskopi gaya atom digunakan untuk menggambarkan struktur permukaan dan mengukur kekasaran lapisan film dua lapis dan dua lapis yang mengandung 0,7%, 0,4%, dan 0,2% minyak atsiri jeruk pahit. Untuk registrasi gambar, digunakan probe silikon berbasis segitiga dengan konstanta gaya 50 nanoNewton.

2.7 Analisis Kalorimetri Pemindaian Diferensial (DSC) pada Film
Untuk menyelidiki perilaku termal dari film yang disiapkan, instrumen kalorimetri pemindaian diferensial (DSC) digunakan. Sekitar 10 mg sampel ditempatkan di dalam sel aluminium. Sampel dipindai pada kecepatan sekitar 10°C/menit. Siklus termal yang digunakan untuk setiap sampel mencakup rentang suhu dari 25°C hingga 250°C di bawah aliran atmosfer nitrogen yang konstan. Titik leleh (Tm) dan suhu transisi gelas (Tg) ditentukan dari kurva suhu (Javidi et al. 2016 ).

2.8 Spektroskopi FT-IR pada Film
Untuk menyelidiki ikatan kimia dari bahan-bahan yang membentuk film, film yang dihasilkan dianalisis menggunakan spektrometer Fourier Transform Infrared (FTIR) Attenuated Total Reflectance (ATR) (Zomorodian et al. 2023 ). Sampel film dikeringkan dalam desikator gel silika selama 7 hari sebelum analisis. Selanjutnya, potongan film dengan diameter 2 cm ditempatkan di antara dua jendela KBr. Spektrum ATR direkam dalam rentang bilangan gelombang 400 hingga 4000 cm −1 .

2.9 Penilaian Sifat Antioksidan pada Film yang Dihasilkan
Aktivitas antioksidan dinilai menggunakan uji penangkal radikal bebas DPPH (Kamkar et al. 2021 ). Secara singkat, 3 mg film dicampur dengan 3 mL metanol selama 5 menit. 1 mL ekstrak ini kemudian ditambahkan ke 1 mL DPPH 1 mM dalam metanol, diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit, dan absorbansi pada 517 nm diukur menggunakan spektrofotometer. Persentase aktivitas penangkal DPPH dihitung menggunakan rumus Williams et al. (1995):

Dalam rumus ini, A_blank menunjukkan penyerapan optik dari kontrol negatif tanpa film (larutan DPPH metanol), dan A_sample menunjukkan kerapatan optik dari berbagai konsentrasi ekstrak film.
2.10 Evaluasi Efek Antimikroba BOEO dan Film Produksi
Untuk mengevaluasi aktivitas antimikroba minyak, uji difusi cakram dan sumur dilakukan menggunakan media agar. Setelah menyiapkan galur bakteri (CFU/ml 10 8 ), kultur permukaan dilakukan menggunakan usapan steril dengan 1,0 mL kultur cair yang mengandung 10 6 bakteri yang diinginkan ( Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus ) pada media kultur Tryptone Soy Agar. Plat yang diinokulasi digunakan untuk uji difusi cakram dan sumur.

Untuk uji difusi sumur, sumur dengan diameter 6,0 cm dibuat menggunakan pipet steril (1 cc), kemudian ujung sumur ditutup dengan media kultur Tryptone Soy Agar. Setelah dikeringkan di bawah penutup mikrobiologi, 40 μL minyak yang diinginkan ditambahkan ke dalam sumur.

Untuk uji difusi cakram, 10 μL BOEO dituangkan ke cakram kertas steril dengan diameter 6 mm. Setelah kering, cakram dipindahkan ke media kultur yang mengandung bakteri dalam kondisi steril. Di setiap pelat, 3 hingga 4 cakram ditempatkan dengan jarak yang sama satu sama lain. Pelat kemudian diinkubasi pada 37°C dalam inkubator selama 24 jam. Setelah inkubasi, pertumbuhan bakteri dievaluasi dengan mengukur diameter zona penghambatan yang terbentuk, yang menunjukkan kemanjuran antimikroba. Untuk memastikan pertumbuhan bakteri yang seragam pada permukaan pelat, pelat tanpa cakram dan sumur disertakan untuk setiap bakteri yang diuji. Selain itu, pelat tanpa bakteri digunakan untuk memastikan sterilitas lingkungan kultur (Gómez-Estaca et al. 2010 ).

Untuk menilai sifat antimikroba dari film yang dibuat, metode kontak langsung digunakan. Pertama, sampel film steril dengan diameter 5,1 cm disiapkan dan ditempatkan pada media kultur Tryptone Soy Agar yang mengandung 106 bakteri dan pada pelat yang mengandung media kultur Tryptone Soy Agar dengan 106 bakteri , mengikuti metode oleh Atef et al. ( 2019 ). Selanjutnya, semua pelat diinkubasi pada 37°C dalam inkubator selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, pertumbuhan bakteri dievaluasi, dan untuk memastikan pertumbuhan bakteri yang seragam pada permukaan pelat, pelat tanpa film disertakan untuk setiap bakteri yang diuji. Selain itu, pelat tanpa bakteri digunakan untuk mengonfirmasi sterilitas lingkungan kultur.

2.11 Evaluasi Efek Antimikroba Film pada Fillet Ikan
2.11.1 Persiapan Ikan
Ikan trout pelangi dengan berat rata-rata 300–400 g dan panjang rata-rata 30 cm dibeli dari sebuah peternakan ikan di Kabupaten Noor. Setelah mengeluarkan isi perut dan sisik, fillet disiapkan dan dipotong-potong berukuran 2 × 2 cm. Setelah dicuci bersih, potongan-potongan tersebut ditempatkan di bawah penutup mikrobiologi untuk memastikan bahwa fillet bebas dari kelebihan air.

2.11.2 Persiapan Film Antimikroba
Seperti disebutkan dalam pendahuluan, tujuan penelitian ini adalah untuk menyiapkan film biodegradable dengan efikasi antimikroba yang sesuai untuk meningkatkan masa simpan fillet ikan trout pelangi selama penyimpanan dingin. Setelah menyiapkan film biodegradable yang mengandung minyak jeruk pahit dalam jumlah yang berbeda dan menilai sifat fisik, mekanis, dan termalnya, film terbaik yang menunjukkan karakteristik yang dapat diterima baik secara fisik, mekanis, dan antimikroba dipilih. Film antimikroba dengan 1,2% BOEO dipilih untuk digunakan sebagai pelapis pada fillet ikan trout pelangi selama periode penyimpanan di lemari es. Fillet ikan yang dipotong (sekitar 2 × 2 cm) dilapisi dengan film yang dihasilkan, dan untuk mengukur beban mikroba dan perubahan kimia, mereka disimpan di lemari es pada suhu 4 ° C selama 16 hari. Evaluasi dilakukan setiap 4 hari selama periode penyimpanan ini.

2.12 Evaluasi Beban Bakteri pada Fillet Ikan Trout Pelangi
Sejumlah 5 g sampel fillet ikan trout pelangi dihomogenkan dengan 45 mL larutan garam fisiologis dalam kondisi steril hingga seragam. Selanjutnya, pengenceran yang sesuai disiapkan, dan 1 mL homogenat digunakan untuk mengkultur Enterobacteriaceae (dikultur dalam rangkap dua dalam kondisi anaerobik), bakteri asam laktat (dikultur dalam rangkap dua dalam kondisi anaerobik), bakteri psikrotrofik, dan total bakteri menggunakan metode pour plate dalam media Violet Red Bile Dextrose Agar (VRBD), MacConkey Agar (MRSA), dan Tryptone Soy Agar (TSA), masing-masing (Sayyari et al. 2021 ). Penghitungan bakteri psikrotrofik dan total beban bakteri dilakukan pada suhu 7°C selama 10 hari dan pada suhu 30°C selama 2 hari. Penghitungan bakteri asam laktat dilakukan pada suhu 30°C selama 3 hari, dan penghitungan Enterobacteriaceae dilakukan pada suhu 30°C selama 2 hari (Gómez-Estaca et al. 2010 ).

2.13 Pengukuran pH dan TBA Fillet Ikan Selama Penyimpanan
Sampel jaringan (masing-masing 5 g) dihomogenisasi dalam 50 mL air suling, dan pH-nya ditentukan menggunakan pH meter digital.

Pengukuran TBA dilakukan dengan menggunakan teknik kolorimetri. Sampel 200 mg ikan cincang ditambahkan ke dalam labu 25 mL, kemudian diencerkan dengan 1-butanol hingga tanda batas. Sebanyak 5 mL larutan ini dipindahkan ke tabung reaksi kering yang ditutup, diikuti dengan penambahan 5 mL reagen TBA (yang dibuat dengan melarutkan 200 mg TBA dalam 100 mL 1-butanol setelah penyaringan). Tabung reaksi yang tertutup rapat kemudian ditempatkan dalam penangas air pada suhu 95°C selama 2 jam sebelum didinginkan hingga mencapai suhu kamar. Akhirnya, absorbansi pada 532 nm diukur terhadap blanko air suling, dan nilai TBA (dalam miligram malondialdehid per kilogram jaringan ikan) dihitung menggunakan persamaan yang ditentukan: TBA = ((As − Ab) × 50)/200.

2.14 Analisis Data
Untuk menggambar grafik dalam penelitian ini, digunakan perangkat lunak Sigma Plot 12 dan Origin 8.5. Selain itu, analisis statistik data dilakukan menggunakan perangkat lunak Excel dan SPSS 16. Awalnya, kenormalan data dinilai dalam SPSS menggunakan uji Kolmogorov–Smirnov, diikuti dengan pengecekan homogenitas varians menggunakan uji Levene. Analisis varians satu arah (ANOVA) dengan uji post hoc Dunnett digunakan untuk membandingkan secara statistik sifat-sifat film dan menganalisis nilai-nilai kuantitatif yang diperoleh dari analisis mikroba. Semua hasil dari tiga replikasi disajikan sebagai mean ± simpangan baku, dan perbandingan statistik dilakukan pada tingkat kepercayaan 95%.

3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Sifat Mekanik Ketebalan, Kekuatan Tarik, Perpanjangan
Seperti yang diamati pada Tabel 3 , ketebalan film dwi lapis yang dihasilkan dengan menambahkan kitosan menurun secara signifikan dibandingkan dengan film kontrol. Selain itu, sementara penambahan kitosan meningkatkan perpanjangan film saat putus, perpanjangan tersebut menurun pada saat putus, dan kekuatan tarik meningkat. Penambahan BOEO mengakibatkan peningkatan ketebalan film dwi lapis dibandingkan dengan sampel kontrol, yang dapat dikaitkan dengan terperangkapnya tetesan mikro BOEO dalam film dwi lapis. Lebih jauh lagi, penambahan minyak jeruk pahit menyebabkan penurunan perpanjangan saat putus dan penurunan kekuatan tariknya, yang dapat disebabkan oleh terciptanya struktur heterogen dan terputus-putus dalam film ini. Li et al. (2019) mengungkapkan bahwa penambahan minyak atsiri kunyit ke dalam matriks kitosan menyebabkan penurunan TS dari film yang disiapkan. Dalam penelitian lain, penggunaan minyak atsiri jahe (GEO) dalam film berbasis kitosan mengakibatkan penurunan TS (Al-Ali et al., 2021).

TABEL 3. Hasil ketebalan, kekuatan tarik, dan persentase perpanjangan film dwi lapis PLA-kitosan/pati yang mengandung BOEO.

Catatan: Hasil dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± SD ( n  = 3). Huruf yang berbeda dalam gambar yang sama berarti perbedaan statistik ( p  < 0,05).

3.2 Permeabilitas Uap Air, Sudut Kontak, Kelarutan, dan Penyerapan Air pada Film Bilayer PLA-Chitosan/Pati yang Mengandung BOEO
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4 , penambahan kitosan meningkatkan nilai sudut kontak, kelarutan, dan penyerapan air pada film, yang mungkin disebabkan oleh interaksi antara polimer ini, seperti gaya elektrostatik dan ikatan hidrogen. Nilai permeabilitas uap air menurun, yang dapat disebabkan oleh film kitosan yang memiliki sifat menolak air yang lebih tinggi (afinitas air lebih rendah) dibandingkan dengan pati, yang pada akhirnya mengakibatkan berkurangnya permeabilitas uap air. Lebih jauh lagi, dengan penambahan BOEO ke matriks film dwi lapis, nilai permeabilitas uap air, kelarutan, dan penyerapan air menurun. Penurunan ini mungkin disebabkan oleh peningkatan aliran uap air, yang dapat dikaitkan dengan susunan dan senyawa yang ada dalam jeruk pahit yang menyebabkan perubahan pada struktur molekul permukaan polimer. Akibatnya, kerapatan struktur permukaan menurun, mempercepat aliran uap air dari dalam film. Selain itu, nilai sudut kontak meningkat, yang disebabkan oleh sifat anti air dari minyak esensial jeruk pahit yang ditambahkan ke dalam film, sehingga mencegah air memasuki struktur film (Zhang et al. 2021 ).

TABEL 4. Hasil sudut kontak pada waktu awal, permeabilitas uap air, kelarutan, dan penyerapan air pada lapisan film bilayer PLA-kitosan/pati yang mengandung BOEO.

Catatan: Hasil dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± SD ( n  = 3). Huruf yang berbeda dalam gambar yang sama berarti perbedaan statistik ( p  < 0,05).

3.3 Hasil Kolorimetri dari Lapisan Ganda Pati Asam Polilaktat/Kitosan yang Mengandung Konsentrasi BOEO yang Berbeda
Hasil sifat kolorimetrik menunjukkan bahwa pembentukan film dwi lapis menyebabkan perubahan signifikan pada indeks b* (biru-kuning) dibandingkan dengan film satu lapis (Tabel 5 ). Mengenai indeks L* (kecerahan), dapat dikatakan bahwa pembentukan film dwi lapis memberikan dampak signifikan terhadap transparansi film, di mana film pati dan film komposit (25% dan 50% pati) tampak lebih kuning dibandingkan dengan film kitosan. Hal ini dapat dikaitkan dengan warna alami dan sifat pati yang menyerap cahaya pada panjang gelombang yang lebih rendah. Dengan peningkatan jumlah BOEO dalam sistem asam polilaktat/kitosan:pati, perbedaan signifikan pada faktor L* dan a* diamati pada tingkat 1/2% di mana nilai b* tertinggi (kuning) diamati pada film asam polilaktat/kitosan:pati yang mengandung 1/2% BOEO. Variasi warna dan indeks warna menurun secara signifikan dengan peningkatan kandungan minyak. Namun, seiring dengan peningkatan jumlah minyak jeruk pahit hingga level 1/2%, indeks keputihan meningkat secara signifikan. Penyebab fenomena ini dapat dikaitkan dengan komponen BOEO, karena senyawa fenolik yang ada dalam minyak ini mampu menyerap cahaya pada panjang gelombang yang lebih rendah.

TABEL 5. Hasil parameter warna film dwilapis PLA-kitosan/pati yang mengandung BOEO.

Catatan: Hasil dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± SD ( n  = 3). Huruf yang berbeda (a, b, c) dalam perlakuan yang berbeda menunjukkan perbedaan statistik * ( p  < 0,05).

3.4 Mikroskop Elektron Pemindaian (SEM)
Hasil dari Scanning Electron Microscopy ditunjukkan pada Gambar 1a . Gambar SEM dari film ST:100CH0 dan ST:0CH100 menunjukkan permukaan yang relatif halus tanpa pori-pori dan retakan. Ketika kandungan pati meningkat dari 25% menjadi 75%, susunan permukaan yang berbeda diamati dalam film dwi lapis, menyerupai struktur yang kasar dan bersisik. Fenomena ini mungkin disebabkan oleh orientasi gugus fungsi polar ke arah permukaan atas film komposit. Gambar penampang film kitosan, film pati, dan film kitosan/pati menunjukkan morfologi homogen kontinu dengan struktur padat dan tidak ada ketidakteraturan seperti gelembung atau pori-pori, pemisahan fase, yang mungkin disebabkan oleh ikatan antarmolekul antara polimer melalui ikatan hidrogen dan kompatibilitas yang baik antara polimer kitosan dan pati, yang mengarah pada peningkatan stabilitas fase. Pengamatan SEM menunjukkan bahwa film 25PLA/75CHST hampir halus, seragam, dan tanpa gelembung, pori-pori, atau retakan (Gambar 1b ). Pandangan permukaan dan gambar penampang film yang mengandung BOEO menunjukkan beberapa perubahan dalam struktur polimer, seperti pembentukan pori-pori, diskontinuitas, dan pembulatan partikel polimer. Selain itu, distribusi tetesan minyak yang seragam dalam matriks polimer terlihat. Pengamatan menunjukkan bahwa ukuran tetesan minyak meningkat dengan peningkatan konsentrasi BOEO. Pada konsentrasi tinggi zat antimikroba (1/2%), peningkatan volume tetesan minyak dalam larutan film menyebabkan perubahan pada rantai polimer, yang mengakibatkan pembulatan partikel dan pembukaan ruang dalam matriks, yang akhirnya menyebabkan peningkatan kekasaran, penurunan kekuatan tarik, dan penurunan permeabilitas uap air dari film yang dihasilkan. Investigasi serupa diterbitkan oleh Javidi et al. ( 2016 ), di mana mereka menghasilkan film asam poli laktat dengan minyak esensial.

3.5 Mikroskop Gaya Atom (AFM)
Hasil yang diperoleh dari mikroskopi gaya atom (AFM) menunjukkan bahwa dengan peningkatan kandungan kitosan, kekasaran permukaan menurun (Gambar 2 ). Pengurangan kekasaran film mungkin karena interaksi antara dua polimer, kitosan dan pati, yang terkait dengan susunan dan jenis rantai molekul dan jumlah ruang kosong di antara mereka dalam matriks polimer (Chen et al. 2024 ). Selain itu, gaya elektrostatik antara molekul kedua polimer berperan dalam menciptakan perbedaan struktural ini. Namun, hasil penambahan minyak jeruk pahit menunjukkan bahwa dengan peningkatan konsentrasi minyak, kekasaran permukaan film meningkat. Film yang mengandung minyak esensial jeruk pahit menunjukkan lebih banyak ketidakseragaman dibandingkan dengan film kontrol. Fenomena ini mungkin karena akumulasi tetesan minyak setelah pengeringan pada permukaan film, menciptakan ketidakteraturan matriks permukaan (Javidi et al. 2016 ). ( 2016 ) juga melaporkan bahwa penambahan minyak atsiri Origanum vulgare L. pada film berbasis PLA menyebabkan peningkatan kekasarannya. Di sisi lain, penggunaan minyak atsiri jahe menurunkan kekasaran permukaan film berbasis kitosan/polivinil (Chen et al. 2024 ).

3.6 Perilaku Termal
Kalorimeter pemindaian diferensial (DSC) dari film yang disiapkan ditunjukkan pada Gambar 3. Dua puncak endotermik diamati untuk semua film; puncak endotermik pertama dalam kisaran suhu dari 43,2 °C hingga 71,9 °C dikaitkan dengan fenomena seperti fiksasi air yang diserap, asam asetat residu, degradasi polimer, dan suhu leleh polimer. Sementara itu, puncak kedua dalam kisaran suhu dari 87,4 °C hingga 163,4 °C menunjukkan dekomposisi termal karena dekomposisi pirolitik dari struktur kitosan. Dengan peningkatan jumlah kitosan dalam film dwi lapis, titik leleh (Tm) dan stabilitas termal film menurun, yang sejalan dengan peningkatan volume bebas polimer dan mobilitasnya. Selain itu, dengan menambahkan BOEO ke matriks film berbasis PAC, suhu leleh (Tm) dan suhu transisi gelas (Tg) sampel sedikit meningkat. Pengamatan ini menunjukkan bahwa penambahan minyak jeruk pahit meningkatkan stabilitas termal dari film yang telah disiapkan, yang mungkin disebabkan oleh interaksi minyak jeruk dan kitosan dan menghasilkan struktur kristal yang lebih tinggi (Pankaj et al. 2014 ). Hasil ini sejalan dengan penelitian Liu et al. ( 2024a ) ketika mereka melaporkan bahwa keberadaan minyak esensial meningkatkan sifat termal film komposit berbasis kitosan. Selain itu, terbukti bahwa penambahan 10% minyak esensial serai dan kayu cedar dapat meningkatkan stabilitas termal film kitosan (Shen dan Kamdem 2015 ).

3.7 Fourier Transfer Inframerah (FTIR)
Ikatan kimia film berbasis kitosan diilustrasikan dalam Gambar 4. Dalam spektrum film kitosan, puncak yang kuat dalam kisaran 3351 cm −1 dikaitkan dengan getaran peregangan gugus OH, yang tumpang tindih dengan getaran peregangan gugus NH dalam kisaran yang sama (Chen et al. 2024 ). Selain itu, puncak yang diamati pada 1578 cm −1 dapat dikaitkan dengan pembengkokan NH (amida II). Dua puncak kecil pada 1655 cm −1 dan 1741 cm −1 masing-masing dikaitkan dengan getaran peregangan C=O (amida I) dan keberadaan gugus karbonil (Ji et al., 2017). Dalam spektrum film kitosan, puncak kuat dalam kisaran 3351 cm −1 dikaitkan dengan getaran peregangan gugus OH, yang tumpang tindih dengan getaran peregangan gugus NH dalam kisaran yang sama (Chen et al. 2024 ). Setelah menggabungkan minyak jeruk pahit, beberapa puncak ini dalam spektrum film berbasis PC yang mengandung 1,2% BOEO bergeser ke panjang gelombang yang lebih tinggi atau lebih rendah. Dalam film berbasis PC yang mengandung 1,2% BOEO, peningkatan gugus alkil (CH, CH2, dan CH3) dalam kisaran 2860 cm −1 hingga 2990 cm −1 menunjukkan peningkatan hidrofobisitas. Selain itu, puncak baru muncul dalam rentang panjang gelombang antara 1400 cm −1 dan 1600 cm −1 , yang dapat dikaitkan dengan keberadaan beberapa saturasi hidrokarbon aromatik seperti karvakrol, timol, p-simena, γ-terpinena, dan senyawa fenolik dalam BOEO. Oleh karena itu, penambahan BOEO mengubah komposisi molekuler dan interaksi antarmolekul dalam matriks film, yang dihasilkan dari interaksi antarmolekul antara kitosan dan BOEO. Hasil ini selaras dengan penelitian Mehdizadeh et al. ( 2020 ) dan Chen et al. ( 2024 ).

3.8 Analisis Antioksidan
Aktivitas penangkal radikal DPPH dari film berbasis PC diilustrasikan dalam Gambar 5. Seperti yang dapat dilihat, penambahan BOEO menghasilkan peningkatan signifikan dalam kapasitas antioksidan film berbasis PC. Kemampuan antioksidan tertinggi diamati pada 2,2% BOEO, sedangkan yang terendah tercatat dalam formulasi 75PLA/25CHST. Aktivitas antioksidan yang lebih rendah dari film dwi lapis dapat dikaitkan dengan reaksi antara radikal bebas dan gugus amina bebas yang tersisa dari gugus amonium, sedangkan peningkatan aktivitas antioksidan dari film yang mengandung BOEO mungkin disebabkan oleh keberadaan eugenol dan efek sinergis dari polimer yang tersedia, seperti eugenol dan BOEO. Demikian pula, Hafsa et al. (2016) membuktikan bahwa penggunaan minyak esensial EG dapat meningkatkan sifat antioksidan film berbasis kitosan secara luar biasa. Selain itu, Kamkar et al. ( 2021 ) melaporkan bahwa penambahan minyak esensial nano-liposomal meningkatkan aktivitas antioksidan film berbasis kitosan.

3.9 Analisis Antimikroba
Analisis antimikroba dari film yang dihasilkan terhadap berbagai bakteri Gram-positif dan Gram-negatif dilaporkan dalam Tabel 6. Formulasi 75PLA/25CHS tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri, yang dapat dikaitkan dengan sifat antimikroba intrinsik kitosan. Film komposit yang mengandung 0,7% BOEO mampu menghambat L. monocytogenes , S. enteritidis , E. coli , dan sampai batas tertentu, S. aureus secara keseluruhan . Namun, film dwilapis yang mengandung 1,4% dan 2,1% BOEO menunjukkan efek penghambatan yang baik tetapi lebih rendah terhadap bakteri: L. monocytogenes , S. enteritidis , E. coli , dan S. aureus . Efek penghambatan antimikroba dari film kaya BOEO terhadap bakteri dapat disebabkan oleh adanya komponen aktif dalam minyak atsiri yang dapat menguap ke atmosfer. Efek penghambatan yang lebih rendah dari film yang mengandung 1,4% dan 2,1% BOEO dapat dibenarkan oleh fakta bahwa kitosan menurunkan kecepatan pelepasan minyak esensial melalui interaksi antara polimernya dan minyak esensial, sehingga menghasilkan efek penghambatan yang lebih lambat tetapi tahan lama (Li et al., 2019). Faktor lain dapat berupa keberadaan lipopolisakarida dalam bakteri Gram-negatif, yang dapat menghalangi masuknya senyawa aktif ke dalam membran sitoplasma. Sánchez-González et al. ( 2010 ) melaporkan bahwa film minyak esensial kitosan-bergamot menunjukkan kemampuan penghunian yang unggul terhadap pertumbuhan Penicillium italicum . Dalam penelitian lain, Liu et al. ( 2024b ) membuktikan bahwa menambahkan minyak esensial kunyit dalam film kitosan meningkatkan efek penghambatan film terhadap Aspergillus flavus . Penelitian menggunakan minyak esensial Mentha longifolia dalam film kemasan makanan electrospun yang dilaporkan oleh Shahbazi et al. ( 2021 ) menunjukkan bahwa minyak esensial alami dapat memperpanjang masa simpan makanan laut secara signifikan. Hal ini mengonfirmasi temuan sebelumnya dengan minyak esensial jeruk pahit (BOEO) dalam film biodegradable serupa. Film ini, yang dibuat menggunakan electrospinning, tidak hanya meningkatkan kekuatan dan sifat penghalang kemasan tetapi juga memungkinkan pelepasan minyak esensial antimikroba yang terkendali, sehingga menghambat pertumbuhan bakteri dan meningkatkan keamanan pangan. Pekerjaan kami dengan film yang ditingkatkan BOEO untuk ikan trout pelangi semakin mendukung efektivitas dan keberlanjutan pendekatan ini terhadap pengawetan makanan laut.

TABEL 6. Sifat antimikroba dari film berlapis ganda, film berlapis ganda dari asam polilaktat/kitosan: Pati yang mengandung konsentrasi BOEO yang berbeda terhadap beberapa bakteri gram positif dan negatif.

Catatan: Hasil dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± SD ( n  = 3). Huruf yang berbeda dalam gambar yang sama berarti perbedaan statistik ( p  < 0,05).

3.10 Hasil Perubahan Beberapa Indikator Mikroba Fillet yang Dilapisi Film Olahan Selama Penyimpanan
3.10.1 Menghitung Total Bacterial Load (TVC)
Kandungan TVC selama penyimpanan (16 hari) direpresentasikan dalam Tabel 7 ; total beban bakteri awal ikan yang digunakan ditemukan sebesar 2/85 log 10 CFU/g, yang menunjukkan kualitas ikan yang diolah baik. Seiring berjalannya waktu, tingkat TVC meningkat dalam sampel, dengan TVC tertinggi diamati pada hari-hari terakhir periode penyimpanan dan jumlah terendah terlihat pada hari ke nol. Sampel yang dilapisi dengan film berbasis PC yang mengandung 1,2% BOEO menunjukkan pembusukan yang lebih lambat dibandingkan dengan perlakuan lain, yang ditunjukkan dengan jumlah TVC terendah selama penyimpanan, yang dikaitkan dengan sifat penghambatan yang diinginkan dari minyak esensial jeruk pahit. Kemampuan tertinggi film ini untuk menunda pembusukan dikaitkan dengan senyawa fenoliknya, termasuk karvakrol dan timol, yang dapat melindungi senyawa bioaktif dari degradasi (Pabast et al., 2018). Hasil ini selaras dengan penelitian Lv et al. ( 2018 ) yang menunjukkan bahwa penggunaan polietilenaimina (PEI) dan minyak esensial timi (T) dalam film kitosan menunda pembusukan mikroba pada irisan Channa argus segar selama penyimpanan dengan jumlah TVC yang lebih rendah. Selain itu, Valipour Kootenaie dkk. ( 2017 ) melaporkan bahwa penggunaan minyak esensial kayu putih dalam film berbasis kitosan menunda laju pertumbuhan TVC pada ikan mas perak selama 16 hari penyimpanan. Studi yang dilakukan oleh Rezaei dan Shahbazi ( 2018 ) memberikan wawasan berharga tentang efektivitas berbagai metode pengawetan dalam mengendalikan pertumbuhan bakteri dan memperpanjang umur simpan produk ikan. Mirip dengan temuan kami tentang penggunaan minyak esensial jeruk pahit (BOEO) dalam film PLA/kitosan, studi ini menunjukkan bahwa film biodegradable lebih efektif daripada penambahan langsung atau pelapis yang dapat dimakan dalam mengurangi bakteri pembusuk seperti bakteri psikrotrofik dan asam laktat. Hal ini menyoroti sifat penghalang yang unggul dan pelepasan agen antimikroba yang terkontrol yang dicapai melalui pengemasan berbasis film. Hasilnya selaras dengan pengamatan kami bahwa film yang mengandung BOEO secara signifikan mengurangi jumlah bakteri dalam fillet ikan trout pelangi selama penyimpanan dalam lemari es, yang menekankan peran pengemasan inovatif dalam menjaga kualitas dan keamanan makanan laut.

TABEL 7. Hasil perubahan bakteri dan pH fillet ikan yang dilapisi dengan film PLA-kitosan/pati yang mengandung BOEO.

Catatan: Hasil dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± SD ( n  = 3). Huruf yang berbeda dalam gambar yang sama berarti perbedaan statistik ( p  < 0,05).

3.10.2 Menghitung Bakteri Psikotropik (PTC)
Tingkat bakteri psikrotropik Gram-negatif (PTC) pada ikan selama penyimpanan dilaporkan dalam Tabel 7. Hitungan bakteri psikrotropik awal untuk semua perlakuan pada hari nol adalah 3,07 log 10 CFU/g, yang meningkat selama penyimpanan untuk semua sampel. Meskipun semua sampel yang dilapisi menunjukkan tingkat yang dapat diterima untuk konsumsi pada hari ke-8, sampel yang dilapisi dengan film berbasis PC yang mengandung 2,1% BOEO memiliki jumlah PTC terendah pada hari penyimpanan yang disebutkan dibandingkan dengan sampel lain, yang dihasilkan dari efek penghambatan senyawa fenolik, yang memiliki dampak besar pada fungsi enzim bakteri, yang mengakibatkan kebocoran konstituen intraseluler (Ouattara et al. 2000 ). Ojagh et al. ( 2010 ) menunjukkan bahwa penambahan minyak kayu manis ke film kitosan menunda pertumbuhan bakteri psikrotropik Gram-negatif pada ikan trout pelangi.

3.10.3 Menghitung Bakteri Asam Laktat
Hasilnya menunjukkan tren peningkatan jumlah bakteri asam laktat (BAL) pada semua perlakuan selama periode penyimpanan (Tabel 7 ). Laju pertumbuhan BAL ditemukan serupa pada kontrol dan sampel yang dilapisi film berbasis PC, sedangkan fillet yang dilapisi film berbasis PC yang mengandung h 1,2% BOEO menunjukkan tingkat BAL yang lebih rendah selama penyimpanan, yang menunjukkan efek sinergis positif dari kitosan dan BOEO untuk menjaga kualitas ikan. Cai et al. ( 2019 ) mengungkapkan bahwa pemanfaatan minyak atsiri lemon dan timi dalam film kitosan mengurangi laju pertumbuhan BAL pada fillet ikan mas rumput. Penggunaan minyak atsiri Z. multiflora bersama dengan kitosan juga ditemukan efektif untuk memperlambat pertumbuhan BAL pada fillet ikan trout pelangi (Raeisi et al. 2020 ).

3.10.4 Menghitung Bakteri Enterobacteriaceae
Tingkat awal bakteri Enterobacteriaceae pada hari pertama penyimpanan untuk semua perlakuan adalah 2,11 log 10 CFU/g, yang meningkat seiring waktu, dengan peningkatan yang lebih intens diamati pada perlakuan yang tidak tertutup dan film berbasis PC dibandingkan dengan perlakuan yang mengandung BOEO (Tabel 7 ). Pada hari ke-16, tingkat bakteri Enterobacteriaceae dalam perlakuan ini adalah 8,17 log 10 CFU/g pada kontrol, 06,8 log 10 CFU/g pada 75PLA.25CHST, dan 99,6 log 10 CFU/g pada CAEos 2,1%. Fenomena ini dapat dikaitkan dengan efek perlindungan BOEO terhadap bakteri ini, karena mengandung banyak senyawa fenolik, yang menghambat pertumbuhan bakteri. Moosavi-Nasab et al. ( 2016 ) menyarankan bahwa penggunaan lapisan kitosan yang diperkaya dengan minyak esensial lada hitam dapat mengurangi laju pertumbuhan bakteri Enterobacteriaceae pada ikan mas biasa yang disimpan. Selain itu, Cai et al. ( 2019 ) menunjukkan bahwa penggunaan minyak esensial lemon dan thyme dalam pelapisan kitosan dapat mengurangi tingkat bakteri Enterobacteriaceae dalam fillet ikan mas rumput selama penyimpanan.

3.11 Tingkat pH
Perubahan tingkat pH direpresentasikan dalam Tabel 7. Hasilnya menunjukkan perubahan pH dari waktu ke waktu dalam semua perlakuan, dengan tingkat pH menurun dari 6,36 pada hari nol menjadi 4,17 pada hari ke-16 dalam sampel kontrol. Perubahan pH dalam sampel kontrol lebih terlihat daripada yang ada pada perlakuan lain, yang berakhir dengan tingkat pH yang lebih tinggi pada akhir penyimpanan. Sementara itu, tingkat pH dalam sampel yang ditutupi dengan 2,1% CAEO mencapai 9,46 pada akhir periode. Penurunan pH diamati pada awal penyimpanan, yang dapat dianggap sebagai hasil dari pelarutan CO2 dari pemecahan glikogen dalam jaringan ikan dan pembentukan asam karbonat. Peningkatan pH dalam kontrol dan perlakuan yang ditutupi dapat dikaitkan dengan peningkatan produksi senyawa volatil seperti amonia dan trimetilamina karena aktivitas enzimatik bakteri. pH yang lebih rendah dalam fillet yang ditutupi dengan film BOEO sepanjang penyimpanan dapat disebabkan oleh efek penghambatan potensial dari senyawa fenolik yang tersedia di BOEO pada aktivitas bakteri dan protease enzimatik. Kamkar et al. ( 2021 ) mengumumkan bahwa penggunaan minyak atsiri nano-liposomal bersama dengan 1% kitosan dapat menurunkan tingkat pH pada fillet dada ayam. Zomorodian et al. ( 2023 ) merekomendasikan bahwa penggunaan film kitosan yang mengandung ZM-PE menurunkan tingkat pH pada salmon. Majidiyan et al. ( 2022 ) melaporkan bahwa penambahan minyak atsiri rami industri secara efektif memperlambat peningkatan pH, menjaga kesegaran fillet ikan dari waktu ke waktu. Demikian pula, dalam penelitian kami, penggunaan film PLA/kitosan yang mengandung minyak atsiri jeruk pahit (BOEO) secara signifikan menghambat kenaikan tingkat pH selama penyimpanan dalam lemari es. Kedua penelitian menunjukkan bahwa minyak atsiri alami dapat menekan aktivitas mikroba dan mengurangi produksi senyawa nitrogen basa, yang bertanggung jawab atas peningkatan pH pada produk ikan.

3.12 Tingkat TBARS
Tingkat TBARS selama 16 hari diilustrasikan dalam Gambar 6. Hasilnya menunjukkan bahwa tingkat TBA rendah di semua sampel pada hari pertama penyimpanan, yang meningkat perlahan hingga hari terakhir. Tren peningkatan tingkat TBA ini dapat dikaitkan dengan pembusukan oksidasi sekunder lemak. Tingkat TBA tertinggi diamati dalam sampel kontrol, sedangkan tingkat terendah terkait dengan sampel yang ditutupi dengan 2,1% CAEos selama seluruh durasi penyimpanan. Tingkat TBA terendah dalam sampel ini mungkin disebabkan oleh sifat oksidatif BOEO. Kamkar et al. ( 2021 ) membuktikan bahwa minyak esensial nano-liposomal dalam film kitosan menunjukkan efek penghambatan yang sangat baik terhadap TBARS dalam fillet dada ayam. Itu juga ditunjukkan oleh Zomorodian et al. ( 2011 ) bahwa film kitosan yang diperkaya dengan minyak esensial Zataria multiflora mampu mengurangi tingkat TBARS pada salmon. ( 2021 ) melaporkan penurunan signifikan pada sampel udang yang dikemas dengan lapisan minyak atsiri Mentha longifolia selama periode penyimpanan. Hal ini menegaskan sifat antioksidan minyak atsiri dan efektivitasnya dalam menghambat peroksidasi lipid. Temuan ini sejalan dengan penelitian kami tentang minyak atsiri jeruk pahit (BOEO) dalam lapisan PLA/kitosan, di mana kami juga mengamati penurunan signifikan pada nilai TBARS pada fillet ikan trout pelangi. Kedua penelitian menunjukkan potensi penggabungan minyak atsiri alami ke dalam bahan kemasan untuk meningkatkan stabilitas oksidatif dan memperpanjang masa simpan produk ikan, menjaga kualitas sensorik, dan mengurangi pemborosan makanan.

4 Kesimpulan
Dalam studi ini, kami menyelidiki pengembangan dan aplikasi film biodegradable berdasarkan asam polilaktat (PLA) dan kitosan:pati, yang diperkaya dengan minyak atsiri jeruk pahit (BOEO), untuk pengawetan fillet ikan trout pelangi. Temuan kami memberikan kontribusi kemajuan signifikan pada bidang pengemasan dan pengawetan makanan, dengan menyoroti beberapa aspek baru dari pendekatan kami. Pertama, penggabungan BOEO ke dalam film PLA/kitosan:pati menunjukkan peningkatan yang nyata dalam aktivitas antimikroba. Konsentrasi optimal 1,2% BOEO secara efektif menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif, yang diketahui berkontribusi terhadap pembusukan pada produk makanan laut. Aplikasi baru minyak atsiri alami ini sebagai agen antimikroba tidak hanya meningkatkan keamanan pangan tetapi juga sejalan dengan preferensi konsumen terhadap pengawet alami dan tidak beracun. Kedua, studi kami mengungkapkan bahwa film ini secara signifikan mengurangi indikator pembusukan pada fillet ikan trout pelangi selama penyimpanan berpendingin. Dengan memperlambat peningkatan pH dan meminimalkan nilai TBA, kami memberikan bukti bahwa film yang mengandung BOEO dapat mempertahankan kualitas produk ikan dalam jangka waktu yang lama. Temuan ini khususnya relevan dalam mengatasi tantangan menjaga kesegaran pada barang yang mudah rusak, sehingga menawarkan solusi praktis bagi industri makanan laut. Selain itu, kami mengeksplorasi sifat mekanis dan karakteristik struktural film menggunakan teknik canggih seperti mikroskopi gaya atom (AFM) dan mikroskopi elektron pemindaian (SEM). Hasilnya menunjukkan bahwa penambahan BOEO tidak hanya mengubah morfologi permukaan tetapi juga meningkatkan sifat hidrofobisitas film dan ketahanan termal, memberikan wawasan tentang bagaimana sifat-sifat ini dapat dioptimalkan untuk kinerja yang lebih baik dalam aplikasi pengemasan makanan.