ABSTRAK
Hidrolisat dedak gandum menunjukkan berbagai aktivitas biologis, termasuk aktivitas antioksidan dan imunomodulasi. Hidrolisat enzimatik dapat meningkatkan kapasitas antioksidan protein dedak gandum. Dalam penelitian ini, Alcalase digunakan untuk menghidrolisis protein dedak gandum dan hidrolisat yang dihasilkan dipisahkan dengan ultrafiltrasi, aktivitas antioksidan fraksi F1 (berat molekul > 10 kDa, OBH) adalah yang tertinggi di keempat fraksi, dan dipilih untuk mengeksplorasi karakteristik fungsional: d -galaktosa ( d -gal; 300 mg/kg/hari) menginduksi penuaan tikus CL57BL/6J dan OBH (200, 400, 800 mg/kg/hari) diintervensi selama 8 minggu. Tikus normal dibandingkan dengan tikus tua yang diinduksi oleh d -gal dan tikus tua yang diobati dengan OBH. Intervensi OBH secara signifikan meningkatkan aktivitas antioksidan oksidase pada tikus yang menua, seperti kapasitas antioksidan total, aktivitas katalase dan glutation peroksidase; itu menurunkan kadar malondialdehid, dan mengurangi kadar faktor nekrosis tumor-α, interleukin (IL)-1β dan IL-6 di otak dan serum. Pengamatan patologis menunjukkan bahwa OBH mencegah kerusakan otak. Hasil high-throughput sequencing menunjukkan bahwa kelimpahan relatif Verrucomicrobiota menurun, sedangkan Duncaniella , Paramuribaculum , Odoribacter , dan Alistipes_A meningkat. Analisis metabolomik menunjukkan bahwa OBH terutama mengubah metabolisme gliserofosfolipid, sistein dan metionin. Hasil ini menunjukkan bahwa OBH memiliki potensi besar sebagai makanan fungsional, yang dapat meringankan kerusakan oksidatif dan peradangan dalam serum dan otak, menjaga stabilitas bakteri usus, meringankan gangguan metabolisme dan menunda penuaan.

Singkatan
KUCING
katalase
d -gadis
d -galaktosa
GSH-Px
glutation peroksidase
IL-1β
interleukin-1β (IL-1)
Pesawat IL-6
interleukin-6 (IL)
MDA
malondialdehida
OBH
Hidrolisat dedak gandum
ROS
spesies oksigen reaktif
T-AOC
aktivitas antioksidan total
TNF-α
faktor nekrosis tumor-α
1 Pendahuluan
Penuaan merupakan proses alamiah multifaktorial yang sangat kompleks, dengan ciri khas berupa kemunduran fungsi tubuh, yang meliputi penurunan fungsi antioksidan secara bertahap (Forman 2016 ; Galkin et al. 2019 ). Organisasi Kesehatan Dunia memperkirakan bahwa proporsi populasi global yang berusia ≥ 60 tahun dapat mencapai 2,1 miliar pada tahun 2050, dan dengan meningkatnya populasi yang menua, anti-penuaan muncul sebagai masalah kritis (Wyss-Coray 2016 ). Stres oksidatif memainkan peran kunci dalam menginduksi penuaan dan merupakan hasil dari serangan radikal bebas yang berbahaya pada sel atau isi antar sel (kebanyakan spesies oksigen reaktif [ROS]) (Viña 2019 ). Produksi atau akumulasi radikal bebas yang berlebihan mengganggu keseimbangan redoks, yang menghasilkan stres oksidatif, menyebabkan kerusakan oksidatif pada sel dan biomolekul, dan mengarah pada perkembangan berbagai gangguan, seperti penyakit Alzheimer, kanker, dan penyakit kardiovaskular (Abdi dan Ali 1999 ; Liu et al. 2024 ). Saat ini, telah menjadi tren yang tak terelakkan untuk mengurangi stres oksidatif dan menunda penuaan dengan mengonsumsi makanan dengan aktivitas antioksidan.

Dedak gandum merupakan produk sampingan dari pemrosesan gandum dan memiliki kandungan protein tinggi (13%–20%) (Guan et al. 2018 ). Hidrolisat dedak gandum bersifat bioaktif dan memiliki efek kesehatan positif, seperti aktivitas antioksidan, penurun lipid, dan antidiabetik (Baakdah dan Tsopmo 2016 ; Campos Espinosa et al. 2022 ). Esfandi et al. ( 2019 ) melaporkan bahwa hidrolisis enzimatik protein dedak gandum menghasilkan hidrolisat yang dapat memengaruhi kapasitas stres antioksidan hepatosit, dan hidrolisat ini mencegah kematian sel yang diinduksi stres oksidatif. Beberapa penelitian telah menunjukkan aktivitas penyingkiran radikal bebas yang baik dari produk proteolitik dedak gandum (Walters et al. 2020 ). Namun, penelitian tersebut terutama berfokus pada kapasitas antioksidan in vitro dari hidrolisat dedak gandum; Dihipotesiskan bahwa hidrolisat dedak gandum memiliki efek penghambatan terhadap stres oksidatif in vivo, dan hanya ada sedikit data mengenai efektivitas hidrolisat dedak gandum dalam mengatur stres oksidatif in vivo melalui aktivitas enzim antioksidan, pengaturan mikroba usus, dan metabolit.

d -galaktosa ( d -gal) merupakan gula pereduksi alami, yang dapat diubah menjadi glukosa dalam tubuh untuk metabolisme (Zhao et al. 2021 ). Meskipun demikian, konsentrasi d -gal yang tinggi dimetabolisme menjadi galaktitol dan hidrogen peroksida, yang pada akhirnya menghasilkan ROS, dan peningkatan kadar ROS menyebabkan stres oksidatif, disfungsi mitokondria, dan peradangan dalam berbagai organ mamalia, yang pada akhirnya menyebabkan apoptosis seluler (Xu et al. 2016 ). Penuaan yang diinduksi d -gal pada tikus menunjukkan gejala yang mirip dengan penuaan alami; dengan demikian, model tikus diadopsi secara luas untuk mempelajari farmakologi penuaan (Haider et al. 2015 ). Namun, seperti yang telah kita lihat, ada sedikit laporan tentang efek perlindungan OBH pada otak tikus yang menua.

Oleh karena itu, tujuannya adalah untuk mempelajari peran potensial OBH, yang dipilih dari ultrafiltrasi dengan aktivitas antioksidan terkuat, dalam mengurangi stres oksidatif dan peradangan pada jaringan otak, menentukan parameter fisiologis, stres oksidatif, dan tingkat peradangan pada tikus tua yang diinduksi d -gal. Selain itu, untuk mempelajari kemungkinan efek pengurangan OBH, mikrobiota usus dan metabonomi otak tikus tua yang diinduksi oleh d -gal dianalisis. Tujuannya adalah untuk mengevaluasi fungsionalitas OBH, memberikan dasar teoritis untuk studi mendalam OBH in vivo, dan memberikan saran untuk mengembangkan makanan bergizi dengan fungsi anti-penuaan.

2 Bahan dan Metode
2.1 Bahan Kimia dan Reagen
Dedak gandum diperoleh dari Inner Mongolia Xibei Huitong Agricultural Science and Technology Development Co. Ltd. (Inner Mongolia, Tiongkok). Tabung ultrafiltrasi dibeli dari PALL (AS). Trolox, vitamin C (VC), dan d -gal disediakan oleh Dalian Meilun Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, Tiongkok). Kit uji A045-2 Total protein content, A003-1 malondialdehyde (MDA), A007-1 catalase (CAT), A005-1 glutathione peroxidase (GSH-Px), dan A015-1 total antioksidan capacity (T-AOC) disediakan oleh Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering (Nanjing, Tiongkok), dan asam klorida, natrium hidroksida, dan petroleum eter dengan mutu analitis digunakan.

2.2 Persiapan OBH
Bubuk kasar dedak gandum digiling dan dilewatkan melalui saringan 80 mesh, dihilangkan lemaknya dengan petroleum eter, kemudian dilarutkan dalam air pada rasio bahan-cair 1:20 (b/v), mengatur pH menjadi 9,5 menggunakan 0,5 M NaOH, direndam dalam penangas air 50°C, dan diaduk selama 1 jam kemudian disentrifugasi. 1 M HCl ditambahkan ke supernatan sampai pH diatur menjadi 4,0, yang merupakan titik presipitasi isoelektrik. Campuran dibiarkan diam selama 1 jam dan disentrifugasi. Setelah dilarutkan dalam air deionisasi untuk homogenisasi lebih lanjut, endapan dikenakan pengeringan beku untuk memperoleh protein dedak gandum. Hidrolisis dilakukan dengan Alcalase (15.000 U/g) pada konsentrasi substrat 2% (b/v) pada 50°C dan pH 9,5 selama 3 jam. Larutan campuran disimpan selama 10 menit dalam penangas air mendidih untuk menonaktifkan enzim. Larutan kemudian didinginkan hingga suhu sekitar, disesuaikan dengan pH 4,0, dibiarkan diam selama 30 menit, dan disentrifugasi (14.000  g , 20 menit, 4 °C) untuk memperoleh supernatan yang mengandung hidrolisat protein dedak gandum, yang dikeringkan beku. Akhirnya, bubuk disimpan pada suhu -20 °C sebelum digunakan. Air ultramurni kemudian ditambahkan untuk melarutkan hidrolisat protein dedak gandum pada konsentrasi tertentu dan secara berurutan disaring menggunakan membran ultrafiltrasi dengan kapasitas retensi 10, 3, dan 1 kDa. Empat fraksi (F1–F4) dengan berat molekul > 10, 3–10, 1–3, dan < 1 kDa secara terpisah dikumpulkan, dikeringkan beku, kemudian dilarutkan dalam air ultramurni pada 10 mg/mL untuk menilai kapasitas antioksidan setiap fraksi.

2.3 Uji Aktivitas Antioksidan
2.3.1 Tingkat Penangkalan Radikal Bebas DPPH
Pendekatan DPPH digunakan untuk mengukur kapasitas pembersihan radikal bebas, merujuk pada metode Magangana et al. ( 2021 ) dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, sampel yang diencerkan (10 μL) ditambahkan ke larutan DPPH (190 μL, 60 μM/L) dalam pelat 96-sumur dan disimpan selama 1 jam dalam gelap pada suhu 30°C. Nilai absorbansi dideteksi pada 515 nm menggunakan pembaca pelat mikro. Kurva standar dibuat menggunakan 100–1500 μmol/L Trolox, dan persamaan kurva standar adalah sebagai berikut: y  = 0,0493 x  + 9,9268 ( R 2  = 0,9936). Laju pembersihan DPPH ditentukan dengan menggunakan kurva standar, yang ditunjukkan dengan massa Trolox/g sampel massa kering (μmol/g) menurut Persamaan ( 1 ) seperti yang ditunjukkan di bawah ini:

di mana Y adalah laju pemulungan DPPH (%) oleh sampel atau Trolox, A 1 menunjukkan absorbansi sampel atau Trolox, sedangkan A 0 menunjukkan absorbansi kontrol kosong.
2.3.2 Penentuan ABTS + Scavenging Rate
Kami melaksanakan uji ABTS seperti yang dijelaskan oleh Setti et al. ( 2020 ) setelah sedikit modifikasi. Untuk menyiapkan larutan stok ABTS, 100 mL (7 mM) ABTS dicampur dengan 100 mL kalium persulfat (2,45 mM) dan diinkubasi selama 14 jam pada suhu 30°C dalam gelap. Stok ABTS diencerkan dengan buffer garam penyangga fosfat (0,05 M, pH 7,4) hingga mencapai nilai absorbansi 0,7 ± 0,02 pada 734 nm untuk memperoleh larutan kerja ABTS. Sampel (10 μL) dicampur dengan larutan radikal kation ABTS (190 μL) dalam pelat 96 sumur, membiarkannya bereaksi pada suhu 25°C selama 5 menit dalam gelap. Kemudian, pembaca mikroplat digunakan untuk mengukur absorbansi pada 734 nm. Kurva standar dibuat untuk 100–1000 μmol/L Trolox, dan persamaan kurva standar ditunjukkan di bawah ini: y  = 0,0214 x  + 4,5768 ( R 2  = 0,9959). Metode perhitungannya sama dengan Persamaan ( 1 ), yang ditunjukkan dengan massa Trolox/g massa kering (μmol/g).

2.3.3 Penentuan Kemampuan Reduksi Besi Feri
Kami menganalisis kemampuan reduksi besi ferri seperti yang dijelaskan oleh Samaei et al. ( 2021 ) dengan beberapa modifikasi. Untuk memulai, 200 μL larutan sampel ditambahkan ke tabung reaksi (pengenceran mungkin diperlukan) dengan penambahan 6 mL larutan kerja FRAP (terdiri dari 0,3 M/L (pH 3,6)) buffer asetat, larutan 20 mM/L besi klorida (FeCl 3 ), dan larutan TPTZ 10 mM/L pada rasio 10:1:1; reagen disiapkan baru setiap hari dan 600 μL air suling. Larutan dicampur dengan baik dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu 37°C untuk reaksi. Nilai absorbansi diambil pada 593 nm. Sampel diganti dengan larutan standar FeSO4 ( 50–250 μmol/L) untuk membuat kurva standar, dan persamaan kurva standar adalah sebagai berikut: y  = 7,174 x  − 0,0329 ( R2 =  0,9996), dan hasilnya dinyatakan sebagai konsentrasi Fe2 + (μmol/L).

2.4 Komposisi Kimia dan Komposisi Asam Amino OBH
Kandungan protein ditentukan menggunakan metode Kjeldahl dengan faktor konversi 6,25 (AOAC 1995 ), dan kandungan lipid, air, pati, dan asam amino dianalisis menurut Standar Nasional Tiongkok (masing-masing GB 5009.6–2016, GB 5009.3–2016, GB 5009.9–2016, GB 5009.124–2016).

2.5 Hewan dan Eksperimen
Sebanyak enam puluh tikus jantan CL57BL/6J grade SPF berumur 6–8 minggu dibeli dari Sipeifu (Beijing) Biotechnology Co. Ltd. (Nomor Lisensi SYXK (Jing) 2019-0030). Tikus-tikus tersebut ditempatkan pada suhu 22 ± 2°C, dengan tingkat kelembapan pada kelembapan 50 ± 5%, dan siklus terang dan gelap 12 jam/12 jam. Semua dosis d- galaktosa dan OBH, periode eksperimen yang kami gunakan ditentukan menurut Zhang, He, dkk. ( 2020 ). Setelah 1 minggu pemberian makan aklimatisasi, tikus-tikus tersebut diacak ke dalam enam kelompok ( masing-masing n  = 10): normal (diet normal), model penuaan yang diinduksi d -gal (model); kontrol positif VC (VC); kelompok OBH dosis rendah, sedang, dan tinggi (Tabel 1 ). Tikus dalam kelompok dosis model, VC, dan OBH diberi suntikan subkutan 300 mg/kg d -gal, sedangkan tikus dalam kelompok normal diberi jumlah salin normal yang setara. Tikus dalam tiga kelompok yang diobati OBH diberi gavage setiap hari dengan 200, 400, dan 800 mg/kg OBH, dosis untuk tikus dalam kelompok VC adalah 100 mg/kg, dan kelompok tikus normal dan model diberi gavage dengan air steril. Semua tikus diberi gavage dan disuntik secara berkala setiap hari, dan perubahan berat badan dan asupan makanan mereka dicatat setiap minggu selama 8 minggu. Puasa selama 12 jam setelah gavage terakhir, setelah menimbang tikus, semua tikus dibius dengan isoflurana, darah dikumpulkan melalui pendarahan rongga mata, dan tikus di-eutanasia dengan dislokasi serviks. Jaringan hati dan otak segera dikeluarkan, dicuci dengan salin normal dan ditimbang. Indeks organ dihitung dengan membagi berat organ (mg) dengan berat tubuh (g). Protokol percobaan pada hewan telah disetujui oleh Komite Etika dan Kesejahteraan Hewan Laboratorium Universitas Pertanian Mongolia Dalam.

TABEL 1. Pengelompokan dan pengelolaan hewan.

2.6 Histopatologi Otak
Jaringan otak tikus segera difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama periode 24 jam. Jaringan didehidrasi dengan alkohol gradien sebelum penanaman parafin dan pemotongan dalam irisan 4-μm dan pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E). Gambar patologis diperoleh menggunakan mikroskop cahaya (Nikon Eclipse CI) untuk menentukan perubahan histopatologis.

2.7 Aktivitas Antioksidan Oksidase Dalam Serum dan Jaringan Otak
Sampel darah diambil melalui pengangkatan bola mata, kemudian disentrifugasi (3000 putaran/menit, 4°C) selama 10 menit. Serum dikumpulkan untuk memeriksa indeks biokimia. Larutan garam ditambahkan ke jaringan otak dengan rasio 1:9 (b/v), yang digeser dan homogenat disiapkan dalam penangas air es, diikuti dengan sentrifugasi selama 15 menit pada 3000 putaran/menit untuk memperoleh supernatan.

Kit protein total digunakan untuk menentukan konsentrasi protein sampel (Jiancheng, Nanjing, Cina). Aktivitas antioksidan seperti GSH-Px, CAT, dan T-AOC, serta kandungan MDA dalam serum dan homogenat otak dinilai dalam kit biokimia komersial (Jiancheng, Nanjing, Cina). Menurut petunjuk pabrik, reagen ditambahkan, kemudian supernatan disentrifugasi untuk mendeteksi nilai absorbansi; aktivitas enzim antioksidan dihitung menurut rumus.

2.8 Penentuan Faktor Imun Seluler dalam Serum dan Jaringan Otak
Kit ELISA dari Jingmei (Jiangsu, Tiongkok) digunakan untuk mengukur kadar TNF-α, IL-1β, dan IL-6 dalam serum dan jaringan otak tikus tua. 50 μL berbagai konsentrasi standar ditambahkan ke setiap sumur standar strip, dan 10 μL sampel yang akan diuji ditambahkan ke sumur sampel, diikuti dengan penambahan 40 μL pengencer sampel. Selanjutnya, 100 μL antibodi deteksi berlabel horseradish peroxidase (HRP) dituang ke setiap sumur. Plat ditutup rapat dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. Setelah itu, plat mengalami lima kali pencucian sebelum menambahkan substrat A dan B (50 μL/sumur). Plat dilakukan selama 15 menit pada suhu 37°C dalam kegelapan, setelah itu larutan penghenti ditambahkan untuk menghentikan reaksi. Akhirnya, nilai kerapatan optik (OD) dicatat pada 450 nm dalam waktu 15 menit menggunakan pembaca pelat, sedangkan konsentrasi sampel ditentukan dengan merujuk pada persamaan kurva yang dibangun.

2.9 Pengurutan Gen 16S rRNA Berthroughput Tinggi
Tabung reaksi steril digunakan untuk mengumpulkan feses tikus segar, dan nitrogen cair digunakan untuk pembekuan. Setelah DAN diekstraksi dari feses, jumlah dan kualitas DNA total dianalisis dengan Nanodrop dan elektroforesis gel agarosa 1,2%. TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit dari Illumina digunakan untuk menyiapkan pustaka sekuensing.

Komposisi dan keanekaragaman mikroba sampel tinja dianalisis melalui bioinformatika menggunakan Platform Personal Genescloud.

2.10 Uji Metabolit Diferensial Jaringan Otak
Setelah sampel jaringan otak tikus dicairkan perlahan pada suhu 4°C, 25 mg jaringan otak diambil dan ditambahkan ke dalam larutan metanol/asetonitril/air yang telah didinginkan sebelumnya (500 μL, 2:2:1, v/v), diaduk dan dicampur selama 30 detik. Sampel dihomogenkan (35 Hz, 4 menit) dan kemudian dilanjutkan dengan perlakuan ultrasonik dalam penangas es selama 5 menit, dan langkah-langkah selanjutnya diulang tiga kali. Campuran disimpan pada suhu -40°C selama 1 jam, diikuti dengan sentrifugasi selama 20 menit (14.000  g , 4°C). Kromatografi cair kinerja ultra-tinggi Vanquish (Thermo Fisher Scientific) digunakan untuk mendeteksi supernatan.

Perangkat lunak Proteo Wizard digunakan untuk mengubah data mentah ke dalam format mzXML, sedangkan paket R diadopsi untuk identifikasi metabolit diikuti dengan visualisasi.

2.11 Analisis Statistik
Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga, dan rata-rata ± simpangan baku (SD) digunakan untuk menunjukkan data eksperimen. Analisis varians (ANOVA) dan statistik uji- t dilakukan dengan SPSS 25.0 (IBM, AS), dan dibuat grafiknya dengan GraphPad Prism 8.2.0 (GraphPad Software, AS). Hasil dianggap signifikan jika p  < 0,05.

3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Efek Antioksidan Fraksi Ultrafiltrasi
Aktivitas antioksidan hidrolisat Alkalase (Alc) dan fraksi F1–F4 dinilai secara komprehensif dengan melakukan tiga pengujian berbeda, yaitu kemampuan menangkap DPPH· dan ABTS + , serta kapasitas reduksi ion besi. Penelitian lebih lanjut dilakukan pada fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi (Gambar 1 ).

Efek antioksidan dari hidrolisat Alcalase (Alc) dan fraksi pemisahan ultrafiltrasi ditentukan (Gambar 1 ). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1 , laju pemulungan DPPH· dari fraksi ultrafiltrasi berada dalam urutan menurun dari F1 > Alc>F2 > F3 > F4, dan F1 adalah yang paling kuat dalam pemulungan DPPH·, dengan laju pemulungan 19,83 ± 0,15 μmol Trolox/g. Perbedaan dalam laju pemulungan DPPH· di antara fraksi-fraksi tersebut dapat dikaitkan dengan berat molekul dan komposisi asam amino yang berbeda dalam hidrolisat dan fraksi peptida (Bamdad et al. 2011 ). Demikian pula, Farvin et al. ( 2010 ) menemukan bahwa hidrolisat dengan berat molekul tinggi (> 30 dan 10 – 30 kDa) menunjukkan aktivitas pemulungan DPPH· yang lebih tinggi daripada yang berbobot molekul lebih rendah. Tren kemampuan pengurangan ion ferri identik dengan pemulungan DPPH·, dengan F1 (21,36 ± 0,35 μmol/L) menunjukkan kemampuan pengurangan ion ferri yang jauh lebih kuat daripada Alc dan fraksi yang tersisa ( p  < 0,05), sedangkan F3 dan F4 menunjukkan kemampuan pengurangan ion ferri yang lebih lemah (12,21 ± 0,24 μmol/L dan 11,74 ± 0,35 μmol/L), tanpa perbedaan yang signifikan. Laju pemulungan ABTS + dari F1 (868,57 ± 87,01 μmol Trolox/g) dan F2 (814,84 ± 32,48 μmol Trolox/g) tidak berbeda secara signifikan tetapi keduanya menunjukkan efek yang lebih besar daripada fraksi lainnya mungkin karena sebagian besar senyawa dengan kemampuan pemulungan ABTS + terdapat pada F1 dan F2. F1 (> 10 kDa, OBH) yang diperoleh setelah pemisahan ultrafiltrasi menunjukkan kapasitas pemulungan ABTS + dan DPPH· tertinggi serta reduksi ion besi daripada fraksi lainnya. Yeşiltaş dkk. ( 2023 ) menyatakan bahwa senyawa dengan berat molekul tinggi menunjukkan efek antioksidan tinggi setelah klasifikasi hidrolisat protein kentang yang diperoleh dengan ultrafiltrasi. Wu dkk. ( 2016 ) menganalisis sifat antioksidan dari protein hidrolisat yang diperoleh di Douchi melalui ultrafiltrasi membran dan menunjukkan bahwa protein dengan berat molekul lebih tinggi menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi. Oleh karena itu, F1 (OBH) dipilih untuk mengobati tikus yang menua guna menyelidiki penghambatan OBH terhadap stres oksidatif.

3.2 Komposisi Kimia dan Komposisi Asam Amino OBH
3.2.1 Komposisi Kimia OBH
Komposisi kimia campuran hidrolisis ditentukan: protein (66,48 ± 1,36 g/100 g), pati (5,52 ± 0,28 g/100 g), kadar air (0,89 ± 0,10 g/100 g), dan lipid (1,52 ± 0,09 g/100 g). Hasil OBH adalah 54,2 ± 1,87%.

3.2.2 Komposisi Asam Amino OBH
Komposisi asam amino dari hidrolisat dedak gandum disajikan dalam Tabel 2 , untuk mengidentifikasi asam amino spesifik yang dapat berkontribusi pada sifat antioksidannya. Hidrolisat terdiri dari 17 asam amino, termasuk tujuh asam amino esensial bagi manusia (valin, isoleusin, leusin, fenilalanin, metionin, treonin, dan lisin), yang merupakan 32,60% dari total kandungan asam amino. Khususnya, asam glutamat (119,09 mg/g), asam aspartat (37,09 mg/g), leusin (37,47 mg/g), arginin (33,38 mg/g), dan fenilalanin (30,81 mg/g) diidentifikasi sebagai asam amino dominan dalam OBH. Asam glutamat dan asam aspartat adalah asam amino asam sedangkan arginin adalah asam amino basa, telah dilaporkan bahwa residu asam amino asam dan basa memainkan peran kunci dalam khelasi ion besi. Asam amino basa bertindak sebagai donor hidrogen, sementara asam amino asam menyumbangkan elektron selama interaksi radikal bebas, meningkatkan kapasitas antioksidan (Xu et al. 2023 ; Wang et al. 2022 ). Selain itu, fenilalanina, asam amino aromatik, menunjukkan aktivitas penangkal radikal bebas yang kuat karena struktur aromatik dan gugus fenoliknya (Nimalaratne et al. 2011 ). Temuan-temuan ini secara kolektif menunjukkan bahwa mungkin ada korelasi yang kuat antara komposisi asam amino OBH dan aktivitas antioksidannya.

TABEL 2. Komposisi asam amino hidrolisat dedak gandum.

3.3 Perubahan Berat Badan, Indeks Organ dan Asupan Makanan pada Tikus
Untuk menganalisis bagaimana OBH memengaruhi tikus yang menua, kami memeriksa perubahan berat badan, indeks organ, dan asupan makanan (Tabel 3a–c ). Kami menemukan bahwa perbedaan berat badan, indeks organ, dan asupan makanan tidak menunjukkan perbedaan signifikan di antara tikus kelompok normal, kelompok penuaan yang diinduksi d -gal, dan kelompok tikus yang diintervensi OBH (Zou et al. 2023 ).

TABEL 3. (a) Efek OBH terhadap berat badan pada tikus ( n  = 10). (b) Efek OBH terhadap indeks organ pada tikus ( n  = 10). (c) Efek OBH terhadap asupan makanan pada tikus ( n  = 10).

3.4 Analisis Perubahan Histopatologi
Gambar 2 menunjukkan analisis histopatologi otak dari berbagai kelompok. Jaringan otak pada tikus normal menunjukkan mikrostruktur yang jelas dengan sel-sel piramidal yang tersusun rapat dan nukleolus yang terlihat jelas tanpa kelainan. Di sisi lain, fitur patologis seperti berkurangnya jumlah sel piramidal dan sel piramidal yang tersusun longgar dapat dilihat di dalam jaringan otak dari tikus yang menua. Relatif terhadap kelompok model, kelompok dosis tinggi VC dan OBH menunjukkan sel-sel piramidal yang tersusun rapat dengan jumlah yang relatif tinggi. Oleh karena itu, sel-sel piramidal sebagian hilang di jaringan otak pada tikus yang menua, yang menunjukkan adanya kejadian buruk yang menyebabkan kerusakan saraf. Demikian pula, Guo et al. ( 2022 ) melaporkan bahwa injeksi d -gal jangka panjang menyebabkan kerusakan otak, kerusakan atau kehilangan neuron. Intervensi OBH meringankan kerusakan saraf ini dan melindungi dari kerusakan otak yang disebabkan oleh d -gal secara bergantung dosis.

3.5 Pengaruh OBH terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan Serum dan Otak pada Tikus Penuaan d -Gal
Stres oksidatif merupakan ketidakseimbangan pertahanan antioksidan (enzimatik dan nonenzimatik) dalam suatu organisme, di mana reaksi redoks tubuh yang abnormal menghasilkan radikal bebas berlebih seperti ROS untuk menyerang biomolekul dalam sel (Dedibegovic et al. 2020 ). Ada hubungan erat antara stres oksidatif dan penuaan (Xiang et al. 2019 ). MDA, produk toksisitas oksidatif yang dihasilkan melalui peroksidasi lipid, merupakan indikator penting kerusakan membran sel dan penuaan organisme (Zhang, Yang, et al. 2020 ). Untuk menyelidiki efek antioksidan OBH terhadap tikus penuaan yang diinduksi d -gal, kandungan MDA dievaluasi serta aktivitas T-AOC, CAT, dan GSH-Px dalam serum dan otak tikus.

3.5.1 Pengaruh OBH terhadap Aktivitas Antioksidan Oksidase Serum
Gambar 3A–D menunjukkan efek OBH pada aktivitas enzim antioksidan serum. Dibandingkan dengan kelompok normal, aktivitas serum GSH-Px, CAT, dan T-AOC tikus yang menua berkurang secara signifikan ( p  < 0,01), sedangkan kadar MDA meningkat secara signifikan ( p  < 0,01). Setelah intervensi dengan VC dan OBH, kadar GSH-Px, CAT, dan T-AOC meningkat secara signifikan ( p  < 0,05), sedangkan kadar MDA menurun secara signifikan ( p  < 0,05).

3.5.2 Efek OBH pada Aktivitas Antioksidan Oksidase Otak
Gambar 3E-H menunjukkan peran OBH dalam aktivitas antioksidan di dalam jaringan otak. Perbedaan kadar GSH-Px, CAT, MDA, dan T-AOC pada kelompok model dan kelompok normal berbeda secara signifikan ( p  < 0,01), yang menunjukkan bahwa d -gal dapat menyebabkan kerusakan otak. Dibandingkan dengan kelompok model, kelompok VC, OBH-L, OBH-M, dan OBH-H menunjukkan kadar MDA yang berkurang secara nyata di jaringan otak ( p  < 0,01) tetapi kadar GSH-Px, CAT, dan T-AOC meningkat secara signifikan ( p  < 0,05). Peningkatan aktivitas enzim antioksidan ini berhubungan langsung dengan dosis OBH, dengan kelompok dosis sedang dan tinggi serta kelompok VC menunjukkan efek yang signifikan.

Oleh karena itu, aktivitas GSH-Px, enzim CAT, dan kandungan T-AOC meningkat, dan kandungan MDA menurun dalam serum dan jaringan otak setelah intervensi OBH dibandingkan dengan kelompok model. OBH menghambat kerusakan oksidatif dengan memodulasi enzim antioksidan. Zhao dkk. ( 2021 ) menunjukkan bahwa bibit gandum yang difermentasi secara signifikan meningkatkan aktivitas enzim antioksidan dan mengurangi kadar MDA dalam berbagai jaringan hati, otak, dan usus serta serum.

3.6 Efek OBH pada Respons Inflamasi Serum dan Otak pada Tikus Penuaan yang Diinduksi d -Gal
Produksi ROS yang berlebihan mendorong peradangan, memediasi ekspresi gen pro-inflamasi, dan memulai keadaan peradangan kronis. Pada saat yang sama, sekresi sel inflamasi menyebabkan peningkatan stres oksidatif di lokasi peradangan (Krzemińska et al. 2022 ; Michel et al. 2022 ). Penuaan mengganggu keseimbangan sitokin proinflamasi dan anti-inflamasi, yang mengakibatkan produksi sitokin proinflamasi yang berlebihan seperti IL-6, TNF-α, dan IL-1β (Arnold et al. 2021 ). TNF-α dan IL-6 dapat berfungsi sebagai biomarker penuaan, sementara IL-1β penting untuk memicu peradangan kronis terkait usia (Baiocchi et al. 2021 ; Gonzalo-Calvo et al. 2010 ).

Untuk menyelidiki derajat peradangan, sitokin proinflamasi otak dan serum di setiap kelompok dievaluasi (Gambar 3I–K ). Kadar TNF-α, IL-6, dan IL-1β serum dan otak meningkat secara signifikan pada kelompok model dibandingkan dengan kelompok normal ( p  < 0,001) yang menunjukkan bahwa penuaan yang diinduksi d -gal meningkatkan sekresi beberapa faktor imun. Intervensi OBH secara signifikan mengurangi kadar TNF-α, IL-6, dan IL-1β dalam serum dan otak pada tikus yang menua dibandingkan dengan kelompok model ( p  < 0,001). Secara konsisten, Zou et al. ( 2023 ) menunjukkan bahwa polisakarida pektin Codonopsis pilosula mengurangi faktor-faktor ini di dalam usus dan hati, yang menunda penuaan dengan melemahkan respons inflamasi. Wu et al. ( 2022 ) menunjukkan bahwa hidrolisat protein whey juga mengurangi kadarnya dalam serum tikus yang menua. Oleh karena itu, intervensi OBH dapat mengurangi sekresi sitokin inflamasi dan secara efektif meringankan peradangan pada tikus yang menua.

3.7 Efek OBH pada Mikrobiota Usus pada Tikus Penuaan d -Gal
Ada hubungan erat antara mikrobiota usus dan stres oksidatif, dan tingkat stres oksidatif tubuh dipengaruhi oleh mikrobiota usus melalui sintesis metabolit, mengatur enzim antioksidan, dan menjaga homeostasis usus, sedangkan stres oksidatif dapat memengaruhi mikrobiota usus dengan mendorong disbiosis. (Sun et al. 2024 ; Shandilya et al. 2022 ; Singh et al. 2023 ). Penuaan manusia terkait dengan mikrobiota usus, dan regulasi mikroba usus mungkin dapat mengintervensi penuaan (Du et al. 2021 ). Perubahan mikrobiota usus tikus kelompok intervensi ND, M, dan OBH-H dieksplorasi dengan sequencing gen 16S rRNA berthroughput tinggi.

Berdasarkan penskalaan multidimensi nonmetrik (NMDS), komposisi mikroba yang dipisahkan dari kelompok ND dan M jelas berbeda secara signifikan, dan intervensi OBH memodulasi struktur dan komposisi mikrobiota usus pada tikus yang menua (Gambar 4A ). Kelimpahan mikroba usus dianalisis lebih lanjut pada tingkat filum dan genus. Pada tingkat filum (Gambar 4B ), mikroorganisme usus utama pada tikus kelompok ND, M, dan OBH terdiri dari Bacteroidota , Firmicutes , Actinobacteria , dan Proteobacteria , dengan Bacteroidota dan Firmicutes mewakili 50,96% dan 19,22% atau lebih. Diindikasikan bahwa rasio Firmicutes-ke-Bacteroides (F/B) terkait erat dengan penuaan (Liu et al. 2023 ), dan mereka berubah secara signifikan di antara ketiga kelompok. Rasio F/B dalam kelompok ND adalah 0,65, yang meningkat dari 0,30 menjadi 0,43 dalam kelompok M setelah intervensi OBH. Hal ini konsisten dengan hasil yang dilaporkan sebelumnya (Zhang, Yang, et al. 2020 ; Zhang, He, et al. 2020 ). Selain itu, kelimpahan relatif Verrucomicrobiota berkurang secara signifikan dalam kelompok OBH-H dibandingkan dengan kelompok M. Pada tingkat genus (Gambar 4C ), mikrobiota usus pada tikus di setiap kelompok meliputi CAG-485 , Dubosiella , Duncaniella , Paramuribaculum , CAG-873 , Alloprevotella , Odoribacter , Muribaculum , dan Alistipes_A . Dibandingkan dengan kelompok ND, kelimpahan CAG-485 meningkat secara signifikan dan kelimpahan Dubosiella , Duncaniella , Paramuribaculum , CAG-873 , Odoribacter , dan Alistipes_A menurun secara signifikan pada kelompok M. Intervensi OBH menurunkan kelimpahan relatif CAG-485 dan meningkatkan kelimpahan Duncaniella , Paramuribaculum , CAG-873 , Odoribacter , dan Alistipes_A . Selain itu, analisis varians LEfSe dilakukan, yang menunjukkan bahwa kelompok ND diperkaya dengan o_Lactobacillales , f_Lactobacillaceae , dan p_Actinobacteriota ; kelompok M diperkaya dengan g_CAG_485 , f_Coprobacillaceae , dan g_Bacteroidesg_H; dan kelompok intervensi OBH-H diperkaya dalam g_Paramuribaculum (Gambar 4D ).

3.8 Analisis OBH terhadap Metabolisme Nontarget di Jaringan Otak pada Tikus Penuaan d -Gal
Otak telah dianggap sebagai organ kompleks penting dengan struktur dan fungsi penting pada mamalia, dan ia menjalankan fungsinya melalui neurokimia (Ding et al. 2021 ). Namun, studi tentang metabolom otak kompleks bersama dengan perubahan dalam penuaan masih langka. Analisis metabolit nontarget dari berbagai kelompok tikus tidak hanya membantu mengidentifikasi metabolit spesifik tetapi juga memberikan wawasan tentang mekanisme penghambatan OBH dari stres oksidatif. Studi ini mengeksplorasi bagaimana pemberian OBH memengaruhi metabolom nontarget jaringan otak dari tikus penuaan yang diinduksi d -gal. Secara total, 1336 metabolit diidentifikasi, yang sebagian besar adalah asam amino, glikokonjugat, asam lemak, nukleosida, dan purin. Setelah analisis diskriminan kuadrat parsial terbimbing (PLS-DA), kelompok ND dan M dan kelompok intervensi M dan OBH-H jelas dipisahkan (Gambar 5A,B ).

Selain itu, untuk mengevaluasi metabolit diferensial dalam jaringan otak pada tikus penuaan d -gal melalui gavage OBH, metabolit dalam kelompok ND dan M (Gambar 5C ) dan kelompok M dan OBH-H (Gambar 5D ) dikenakan analisis klaster menggunakan peta panas ( p  < 0,05, VIP > 1 dan FC > 1). Dua klaster berbeda terbentuk di antara metabolit yang berbeda ini, dengan metabolit terbanyak dalam kelompok ND dan M dan kelompok M dan OBH-H berada di cabang yang berbeda. Hasil ini menunjukkan bahwa pemodelan dan gavage OBH yang berhasil dapat mengubah metabolit otak pada tikus yang menua. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5C , dibandingkan dengan kelompok ND, kandungan gliserofosfokolin dan S-formilglutathione menurun secara signifikan dalam jaringan otak kelompok M ( p  < 0,05). Sebaliknya, kandungan iditol, mannitol, galactitol, glucitol, guanosin, dan S-adenosilhomosistein meningkat secara signifikan ( p  < 0,05). Lebih jauh, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5D , kadar S-adenosilhomosistein, prothioconazole, dan PS (20:3(8Z, 11Z, 14Z)/22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) menurun secara signifikan dalam jaringan otak pada tikus kelompok OBH-H ( p  < 0,05) dibandingkan dengan kelompok M. Namun, kadar 1-lisofosfatidilkolin (LysoPC, 18:1(11Z)), fosfatidilkolin (PC, 33:2), fosfoetanolamin (PE, 18:0/20:5 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)), gliserofosfokolin, dan (−)-epigallocatechin (EGC) jelas meningkat ( p  < 0,05). Penelitian ini menggunakan topologi KEGG untuk menganalisis pengayaan jalur metabolisme yang sesuai, dan diamati bahwa metabolisme galaktosa, sistem fosfotransferase, metabolisme gliserofosfolipid, metabolisme fruktosa dan mannosa, metabolisme asam arakidonat, dan metabolisme sistein dan metionin terutama terdiri dari kelompok ND dan M (Gambar 5E ). Di sisi lain, metabolisme gliserofosfolipid, metabolisme sistein dan metionina, karsinogenesis kimia-ROS, dan metabolisme histidina terutama terdiri dari kelompok M dan OBH-H (Gambar 5F ). Tren ini menunjukkan bahwa penuaan yang diinduksi d -gal berhubungan erat dengan metabolisme glukosa, metabolisme sistein dan metionina, dan metabolisme gliserofosfolipid dan bahwa OBH dapat meringankan gangguan metabolik yang diinduksi penuaan d -gal.

Gangguan metabolisme lipid dapat menyebabkan penuaan otak dan disfungsi kognitif (Hu et al. 2022 ). Hubungan potensial antara penuaan otak dan metabolisme lipid ditemukan dalam penelitian ini. Eksperimen mengungkapkan bahwa PE (18:0/20:5 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)), LysoPC (18:1 (11Z)), PC (33:2), dan gliserofosfokolin, sebagai biomarker potensial, dikaitkan dengan metabolisme gliserofosfolipid. Kandungan LysoPC (18:1(11Z)), PC (33:2), PE (18:0/20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)), dan gliserofosfokolin menurun pada tikus penuaan yang diinduksi d -gal dibandingkan dengan tikus ND. Sebaliknya, kandungannya meningkat pada tikus setelah pemberian OBH-H. Hal ini menunjukkan bahwa OBH dapat secara efektif memperbaiki gangguan metabolisme gliserofosfolipid pada tikus penuaan d -gal. Seperti yang dilaporkan sebelumnya, para peneliti mengungkapkan korelasi signifikan antara PS (20:3(8Z, 11Z, 14Z)/22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) dan gangguan metabolisme fosfolipid (Meng et al. 2023 ). Prothioconazole menyebabkan akumulasi trigliserida, mengubah ekspresi gen dan metabolit terkait metabolisme glikolipid dalam tikus, yang memengaruhi jalur metabolisme glikolisis dan piruvat (Tian et al. 2021 ). Baik prothioconazole maupun kadar PS (20:3(8Z, 11Z, 14Z)/22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) menurun pada kelompok intervensi OBH. Metionina menghasilkan donor metil S-adenosilmetionina, dan yang terakhir kemudian ditransformasikan menjadi S-adenosilhomosistein melalui metilasi, terakumulasi selama penuaan (You et al. 2023 ). Dibandingkan dengan kelompok ND, ekspresi S-adenosilhomosistein dalam kelompok M meningkat tetapi menurun setelah pemberian OBH. Hasil ini menunjukkan bahwa OBH secara signifikan mengintervensi metabolisme metionina dan sistein. Hal ini sesuai dengan temuan yang dilaporkan oleh Parkhitko et al. ( 2016 ), yang menunjukkan bahwa menurunkan regulasi jaringan, khususnya S-adenosilhomosistein memperpanjang periode dan umur sehat Drosophila. EGC, sebagai antioksidan potensial dengan kemampuan untuk menetralkan ROS secara efektif, dapat melewati sawar darah-otak ke dalam parenkim otak, meningkatkan diferensiasi neuron, dan menghambat penuaan otak (Ambigaipalan et al. 2019 ). Kelompok intervensi OBH-H secara signifikan meningkatkan kandungan EGC dibandingkan dengan kelompok model penuaan. Oleh karena itu, OBH dapat memperbaiki penuaan dengan mengubah metabolisme pada tikus penuaan yang diinduksi d -gal.

3.9 Korelasi Mikrobiota Usus dengan Metabolit Diferensial
Hubungan antara metabolit diferensial dan mikrobiota usus pada kelompok ND dan M serta kelompok M dan OBH-H dieksplorasi melalui analisis korelasi Spearman. Mikrobiota usus menunjukkan korelasi signifikan dengan berbagai metabolit. Seperti yang disajikan pada Gambar 6A , CAG-485 berkorelasi positif dengan kandungan PS(20:3(8Z, 11Z, 14Z)/22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) dan guanosin, tetapi berkorelasi negatif dengan kandungan ADP-ribosa. Dubosiella berkorelasi positif dengan korelasi LysoPC (18:1(11Z)). Odoribacter berkorelasi negatif dengan glucitol dan galactitol. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6B , Paramuribaculum berkorelasi positif dengan kadar LysoPC (18:1(11Z)) dan (−)-Epigallocatechin (EGC), tetapi berkorelasi negatif dengan kadar prothioconazole dan PS(20:3(8Z, 11Z, 14Z)/22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)). Kandungan PS(20:3(8Z, 11Z, 14Z)/22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) berkorelasi negatif dengan CAG-873 dan Odoribacter . Berdasarkan temuan di atas, mikrobiota usus terkait erat dengan metabolisme sisteina dan metionina, metabolisme gliserofosfolipid, karsinogen kimia, dan ROS, dan mereka bekerja sama untuk memperbaiki penuaan.

4 Kesimpulan
Dalam penelitian ini, kami memperoleh empat fraksi (berat molekul > 10, 3–10, 1–3, dan < 1 kDa) yang diperoleh melalui hidrolisis enzimatik dan ultrafiltrasi protein yang diekstrak dari dedak gandum. Di antara mereka, fraksi F1 (> 10 kDa, OBH) memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dan memberikan perlindungan terhadap kerusakan otak pada tikus penuaan yang diinduksi d -gal. Lebih jauh, ia meningkatkan aktivitas antioksidan serum dan otak pada tikus yang menua dan menurunkan kandungan MDA, produk oksidasi lipid, dan faktor imun dalam serum dan otak. OBH dapat mengatur komposisi mikroba usus. Analisis lebih lanjut dari metabolit jaringan otak mengungkapkan gangguan metabolisme glukolipid selama proses penuaan. OBH dapat mengatur metabolisme gliserofosfolipid dan metabolisme metionina dan sisteina dan menunda proses penuaan tikus yang diinduksi d -gal. Temuan kami memberikan landasan teoritis untuk menyelidiki OBH secara komprehensif sebagai kandidat antioksidan potensial dan untuk sepenuhnya memanfaatkan OBH dapat meringankan stres oksidatif dan peradangan in vivo. Namun, komposisi struktural OBH dan isolasi serta identifikasi hidrolisat, serta mekanisme stres oksidatif in vivo, masih perlu dipelajari lebih lanjut, kami akan mengukurnya menggunakan standar yang dapat digunakan untuk analisis metabolomik yang ditargetkan.