ABSTRAK
Tulang ikan kerapu Eropa ( Dicentrarchus labrax ) dan ikan mas ( Cyprinus carpio ) yang dibudidayakan merupakan sumber kolagen ikan yang penting dan dapat digunakan sebagai pengganti kolagen mamalia. Dalam penelitian ini, kolagen yang larut dalam asam (ASC) diekstraksi dari ikan kerapu Eropa ( Dicentrarchus labrax ; ASC-S) dan ikan mas ( Cyprinus carpio ; ASC-C). Berdasarkan berat kering, kolagen yang diekstraksi dari tulang ikan kerapu dan ikan mas menggunakan perlakuan asam masing-masing adalah 4,06% dan 5,09%. Kolagen yang diekstraksi dari tulang ikan mas lebih tinggi daripada dari tulang ikan kerapu ( p  < 0,05). Glisin adalah asam amino utama dalam kolagen, sedangkan prolin, alanin, hidroksiprolin, arginin dan asam glutamat semuanya cukup melimpah. Selain itu, spektrum FTIR mengungkapkan bahwa puncak amida A, B, amida I, II, dan III kolagen kompatibel dan sangat sebanding satu sama lain. Menurut penelitian menggunakan SEM, kedua kolagen tersebut memiliki struktur berserat dan berpori. Kolagen dari tulang ikan kerapu dan ikan mas ditemukan memiliki suhu denaturasi masing-masing 32,17°C dan 34,76°C, yang lebih tinggi daripada sebagian besar spesies ikan lainnya. Menurut hasil pemeriksaan Difraksi Sinar-X (XRD), kedua kolagen tersebut mempertahankan konfigurasi heliksnya. Hasil ini menunjukkan bahwa lingkungan hidup ikan—baik air tawar maupun air asin—tidak berdampak langsung pada kualitas kolagennya, dan bahwa kolagen ikan dapat digunakan sebagai pengganti kolagen yang berasal dari hewan darat dalam sektor pengemasan makanan, nutraseutika, dan farmasi.

1 Pendahuluan
Ikan adalah makanan yang mudah rusak yang membusuk segera setelah dipanen. Untuk meningkatkan masa simpan ikan, beberapa prosedur pengolahan, seperti pemotongan ikan, penggaraman, pengemasan, atau pengasapan, harus digunakan (Majidiyan et al. 2022 ). Teknik pengolahan ini biasanya menghasilkan limbah dalam jumlah besar—antara 30% dan 70% dari total massa ikan (FAO 2021 ). Limbah pengolahan ikan mengacu pada produk sampingan yang dihasilkan selama pengolahan ikan, seperti kepala, ekor, tulang, dan jeroan. Produk sampingan ini sering dianggap mengganggu dan dibuang di tempat pembuangan sampah atau dibakar, sehingga mengakibatkan pencemaran lingkungan dan kerugian ekonomi. Namun, limbah ini dapat mengandung sejumlah besar nutrisi berharga, seperti protein, lipid, dan mineral, yang dapat dipulihkan dan digunakan sebagai pakan ternak, pupuk, atau biofuel. Dalam beberapa tahun terakhir, ada peningkatan minat untuk memanfaatkan limbah pengolahan ikan untuk menghasilkan produk bernilai tambah, seperti minyak ikan, hidroksiapatit, gelatin, dan kolagen. Kolagen adalah protein struktural yang ditemukan dalam jaringan ikat hewan dan merupakan komponen penting dalam industri kosmetik dan makanan (Giannetto et al. 2020 ). Kolagen ikan telah menarik perhatian karena bioavailabilitasnya yang tinggi, imunogenisitas yang rendah, dan sifat pembentuk gel yang baik (Xu et al. 2018 ). Penelitian telah menunjukkan bahwa kolagen ikan dapat membantu meningkatkan kesehatan kulit dengan meningkatkan hidrasi dan mengurangi munculnya garis-garis halus dan kerutan. Ini juga dapat membantu merangsang produksi kolagen, yang penting untuk menjaga elastisitas dan kekencangan kulit (Sibilla et al. 2015 ). Selain efeknya pada kesehatan kulit, kolagen ikan telah terbukti memiliki sifat anti-inflamasi, yang dapat membuatnya berguna dalam pengobatan kondisi seperti osteoartritis dan rheumatoid arthritis (Luo et al. 2022 ).

Turki memiliki industri akuakultur yang berkembang pesat, dengan fokus pada produksi ikan. Menurut Lembaga Statistik Turki (Lembaga Statistik Turki 2020 ), Turki memproduksi sekitar 421.000 ton ikan dan kerang, yang mencakup spesies seperti ikan kerapu, ikan air tawar, dan ikan trout. Produksi ikan kerapu Eropa ( Dicentrarchus labrax ) di Turki meningkat dari 17.877 ton pada tahun 2000 menjadi 155.151 ton pada tahun 2020 (Lembaga Statistik Turki 2022 ). Akan tetapi, hanya ada sedikit penelitian tentang evaluasi limbah ikan kerapu Eropa ( Dicentrarchus labrax ).

Ikan mas ( Cyprinus carpio ) adalah spesies ikan yang umum ditangkap di Turki sebagai bagian dari kegiatan penangkapan ikan di negara tersebut. Turki menghasilkan sekitar 39.000 ton ikan mas, sebagian besar ditangkap di perairan tawar negara tersebut, seperti sungai, danau, dan danau bendungan (Institut Statistik Turki, 2020 ). Bagian daging ikan mas yang dapat dimakan adalah 27,3%–27,9% dari total berat tubuhnya (Suhenda dan Praseno, 2017 ). Produk sampingan (kepala, kantung renang, tulang, kulit, dan sisik) terbentuk pada tingkat sekitar 50%–70% dari berat ikan selama pengolahan makanan (Liu et al., 2015 ). Produk sampingan ini, yang tidak digunakan secara memadai di banyak tempat, dapat digunakan secara efisien untuk menghasilkan produk bernilai tambah dan mencegah pencemaran lingkungan (Wang et al., 2014 ).

Dapat diprediksi bahwa kolagen yang diperoleh dari berbagai spesies ikan berbeda dalam hal komposisi molekul dan sifat fungsional. Selain itu, diasumsikan bahwa lingkungan dan suhu tubuh mempengaruhi sifat kolagen ikan. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kolagen diekstraksi dari tulang dua spesies ikan yang berbeda, ikan air tawar ( Cyprinus carpio ) dan ikan air asin ( Dicentrarchus labrax ), dan dikarakterisasi dan dibandingkan satu sama lain.

2 Bahan dan Metode
2.1 Spesies Ikan
Ikan kerapu Eropa ( Dicentrarchus labrax ) dan ikan mas ( Cyprinus carpio ) dibeli dari pasar grosir di Kota Adana, Turki. Setelah tulangnya dikeluarkan, sampel yang sudah dibersihkan dicuci dengan air keran. Sebelum digunakan, tulangnya diiris kecil-kecil (panjang 1–2 cm) dan disimpan pada suhu −25°C.

2.2 Pembuatan Kolagen dari Tulang Ikan
Dengan sedikit modifikasi, teknik yang dijelaskan oleh Fatiroi et al. ( 2023 ) digunakan untuk membuat kolagen. Setiap langkah dari proses persiapan dilakukan pada suhu 4°C. Protein non-kolagen diekstraksi dari tulang dengan merendamnya dalam NaOH 0,1 N selama 3 hari pada rasio sampel/larutan alkali 1:10 (b/v). Setiap hari, larutan NaOH diganti, lalu dibersihkan dengan air suling dingin. Untuk mengekstrak kolagen dari tulang, tulang yang telah dideproteinasi didekalsifikasi selama 5 hari pada rasio padatan/larutan 1:10 (b/v) dengan asam etilendiamintetraasetat (EDTA)–4Na 0,5 M (pH 7,4). Larutan diganti setiap 24 jam. Sampel tulang yang mengalami dekalsifikasi ditempatkan dalam larutan butil alkohol 10% 1:10 (g tulang/ml) selama 3 hari, dengan penggantian larutan setiap 24 jam, untuk mengekstraksi lemak. Kolagen diekstraksi dari sampel tulang menggunakan larutan asam asetat 0,5 M selama 3 hari. Setiap 24 jam, larutan diganti, dan filtrat dikumpulkan dalam wadah yang berbeda. Presipitasi garam diterapkan pada campuran ekstrak. Kolagen diendapkan dengan menambahkan NaCl (bubuk) hingga konsentrasi akhir 2,5 M dengan adanya 0,05 M tris (hidroksimetil) aminometana, pH 7,0. Sentrifugasi pada 10.000 rpm selama satu jam digunakan untuk memisahkan endapan yang dihasilkan, yang kemudian dilarutkan dalam asam asetat 0,5 M. Setelah mendialisis larutan yang dihasilkan terhadap larutan asam asetat 0,1 M dan air suling, kolagen yang dilarutkan dalam asam, atau ASC, diproduksi.

2.3 Karakterisasi Kolagen yang Dilarutkan dalam Asam
2.3.1 Hasil Kolagen
Hasil kolagen dihitung menggunakan berat kering bahan, seperti yang ditentukan dalam rumus

2.3.2 Analisis Spektrum Ultraviolet
Dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis Agilent Technologies Cary 100, spektrum UV dari sampel kolagen diperoleh. Pada konsentrasi 0,2 mg/mL, sampel dilarutkan dalam asam asetat 0,5 M. Spektrum UV-Vis dari setiap sampel yang dibersihkan diperoleh dengan mengukur absorbansinya pada berbagai panjang gelombang (antara 200 dan 400 nm).

2.3.3 Spektroskopi Inframerah Transformasi Fourier
Dengan menggunakan spektrometer FT/IR JASCO ATR Pro One Model 6700 (JASCO International Co. Ltd. Hachioji, Tokyo, Jepang), spektrum spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) kolagen diperoleh. Spectra Manager TM II adalah aplikasi perangkat lunak lintas platform yang digunakan untuk analisis data spektrum (JASCO).

2.3.4 Kalorimetri Pemindaian Diferensial
Stabilitas termal ASC dilakukan menggunakan kalorimetri pemindaian diferensial (DSC) (Mettler Toledo, model DSC 3, Schwerzenbach, Swiss). Selama 2 hari, sampel kolagen beku-kering disimpan pada suhu 4°C setelah digel dengan asam asetat 0,05 M pada rasio padat/cair 1:40 (b/v). Instrumen DSC tiga tipe Mettler Toledo (Schwerzenbach, Swiss) digunakan untuk pengukuran.

2.3.5 Difraksi Sinar-X
Menggunakan difraksi sinar-X (XRD; PANanalytical X’Pert High Score Empyrean 45 kV, 40 mA) pada rentang pemindaian 5° hingga 45° dengan kecepatan pemindaian 0,5° menit dan rentang langkah 0,02°, struktur kristal sampel kolagen beku-kering dipastikan.

2.3.6 Mikroskopi Elektron Pemindaian dan Analisis Kimia Unsur
Model Quanta 650 (Colombus, Ohio, ABD) digunakan untuk mikroskop elektron pemindaian (SEM). Permukaan sampel dilapisi dengan emas-paladium (Au/Pd) agar konduktif. Selain itu, metode analisis kimia unsur (EDS) digunakan untuk mengidentifikasi konstituen utama dari beberapa zona superfisial.

2.3.7 Elektroforesis Gel Poliakrilamid–Sodium Dodecyl Sulfate (SDS–PAGE)
SDS-PAGE dilakukan dengan metode Laemmli. Sampel dicampur dengan 5% (b/v) SDS dan dipanaskan pada suhu 85°C selama 10 menit. Campuran tersebut kemudian disentrifugasi pada 8500 ×  g selama 5 menit untuk menghilangkan kotoran yang tidak larut. Sampel yang terlarut dicampur pada rasio 1:4 (v/v) dengan Laemmli ( 1970 ), (4X) (0,5 M Tris–HCl, pH 6,8, mengandung 4% (b/v) SDS, 20% (v/v) gliserol) dengan adanya 10% (v/v) 𝛽ME. Sampel (protein 40 𝜇g) dimasukkan ke dalam gel poliakrilamid yang terbuat dari gel pemisah 10% dan gel penumpukan 5% dan dikenakan elektroforesis pada arus konstan 15 mA/gel, menggunakan unit Mini-PROTEAN II (Bio-Rad Laboratories Inc., Richmond, CA, AS). Setelah elektroforesis, gel difiksasi dengan campuran 50% (v/v) metanol, 10% (v/v) asam asetat dan 0,05% (b/v) CoomassieBlue R-250 selama 2 jam. Akhirnya, gel dihilangkan pewarnaannya dengan campuran 40% (v/v) metanol dan 10% (v/v) asam asetat selama semalam. Penanda protein berat molekul (SeeBlue Plus2 prestained Standard, İnvitrogen Inc., UAS) digunakan untuk memperkirakan berat molekul protein. Gel dicitrakan menggunakan Sistem Pencitraan iBright CL750 (iBright LC 750, İnvitrogen Inc., AS).

2.3.8 Komposisi Asam Amino
Sampel kolagen dihidrolisis selama 24 jam pada suhu 110°C dalam 6 N HCl dengan tekanan yang dikurangi. Peralatan HPLC, model Shimadzu Nexera-X2 digunakan untuk menganalisis asam amino. Analisis dilakukan dalam dua kali ulangan. Periode retensi dan area puncak standar digunakan untuk menentukan dan menghitung asam amino.

2.3.9 Analisis Statistik
Temuan penelitian ini disajikan sebagai rata-rata ± simpangan baku. Paket Statistik untuk Ilmu Sosial (SPSS) (Pallant 2020 ) digunakan untuk melakukan analisis statistik. Untuk menemukan perbedaan antar kelompok, ANOVA satu arah digunakan. Perbandingan berpasangan juga menggunakan uji -T . Signifikansi statistik didefinisikan sebagai nilai- p yang kurang dari 0,05 ( p  < 0,05).

3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Hasil Kolagen
Hasil ASC yang diekstrak dari tulang ikan kerapu (ASC-S) dan ikan mas (ASC-C) masing-masing adalah 4,06% dan 5,09%, berdasarkan berat kering. Ditemukan bahwa produksi kolagen yang berasal dari tulang ikan mas lebih besar daripada tulang ikan kerapu ( p  < 0,05). Spesies ikan dapat sangat bervariasi dalam hasil kolagennya karena berbagai faktor, termasuk usia, sumber jaringan, dan biologi spesies. Hasil kolagen yang diamati dalam penyelidikan kami sebanding dengan tulang ikan kakap merah laut dalam ( Sebastes mentella ) (6,7%) dan tulang Lutjanus sp . (4,53%; Ramli et al. 2019 ). Namun, jumlah tersebut lebih besar dibandingkan dengan hasil tangkapan yang tercatat untuk ikan kerapu gelap ( Epinephelus marginatus ) (0,39%), ikan belanak merah ( Mullus barbatus ) (0,62%), ikan kakap laut biasa ( Pagrus pagrus ) (0,61%), ikan kakap kepala emas ( Sparus aurata ) (1,13%), ikan kakap shi ( Umbrina cirrosa ) (0,41%) dan ikan salmon Atlantik ( Salmo salar ) (0,87%) sisik ikan (Tziveleka et al. 2022 ) dan lebih rendah dibandingkan dengan hasil tangkapan yang dipublikasikan untuk ikan mas hitam (15,5%; Jia et al. 2012 ) dan kulit ikan badut bulu punggung ( Chitala ornata ) (16,04%; Le et al. 2020 ). Menurut Anand et al. ( 2013 ), prosedur ekstraksi asam asetat menghasilkan rendemen kolagen berdasarkan berat kering sebesar 7,5% pada kulit ikan kakap Australia ( Pagrus auratus ) dan 8% pada kulit ikan kerapu Asia ( Lates calcarifer ). Menurut laporan, terdapat perbedaan dalam rendemen kolagen ini tergantung pada spesies, usia, ukuran, kondisi kelaparan, komposisi dan struktur jaringan, serta teknik ekstraksi (Jaziri et al. 2022a , 2022b ; Fatiroi et al. 2023 ; Zhang et al. 2010 ).
3.2 Spektrometer UV-Vis
Penyerapan maksimum kolagen tulang ikan kerapu dan ikan mas yang terbesar diamati pada 232 nm dan 230 nm, masing-masing, seperti yang terlihat pada Gambar 1. Sifat struktural kolagen dapat dipahami lebih baik dengan memeriksa spektrum UV–Vis-nya. Dalam spektrum UV–Vis kolagen tulang ikan, penyerapan maksimum pada 232 dan 230 nm sesuai dengan absorbansi khas kolagen Tipe 1. Pada 280 nm, penyerapan protein sering kali paling tinggi. Triptofan dan tirosin adalah dua asam amino yang sangat menyerap dalam rentang panjang gelombang ini, dan tidak satu pun kolagen ASC-S maupun ASC-C menunjukkan puncak penyerapan pada 280 nm (Huang et al. 2011 ). Kolagen yang diisolasi dari belut berduri Mesopotamia (Göçer et al. 2024 ), ikan kakap mata besar berbintik kulit ungu (Oslan et al. 2022 ), dan ikan lele barbel panjang sirip besar (Zhang et al. 2009 ) menunjukkan hasil yang serupa.
3.3 Spektroskopi Inframerah Transformasi
Fourier Spektroskopi FTIR menawarkan wawasan berharga ke dalam struktur molekuler, menjadikannya alat yang berguna untuk menganalisis dan menentukan struktur sekunder protein (Jiang et al. 2011 ). Dalam studi ini, spektroskopi FTIR digunakan untuk menganalisis gugus fungsi dan struktur sekunder ASC dari ASC-S dan ASC-C. Gambar 2 menampilkan spektrum FTIR ASC dari tulang ikan bass laut Eropa dan ikan mas biasa. Ditemukan bahwa puncak serapan amida A dari ASC-S dan ASC-C masing-masing adalah 3289,96 cm −1 dan 3283,21 cm −1 . Ini terkait dengan getaran peregangan NH dan sering terjadi dalam kisaran 3400–3440 cm −1 (Kaewdang et al. 2014 ). Gugus NH peptida berpartisipasi dalam pembentukan ikatan hidrogen, yang menyebabkan amida A berpindah ke frekuensi yang lebih rendah. Menurut Chen et al. ( 2019 ), puncak serapan pita amida B, yang diukur pada 2958,31 cm −1 , diamati dalam kolagen yang diekstrak dari kulit Ikan Pari Merah ( Dasyatis akajei ). Puncak ini sering terlihat pada rentang 3080 cm −1 dan dikaitkan dengan peregangan asimetris CH₂. Kolagen ASC-C dan ASC-S yang kami pelajari memiliki pita amida B pada 3078,98 cm −1 dan 3073,98 cm −1 , masing-masing. Daerah amida I, II, dan III terkait erat dengan struktur polipeptida. Pita amida I dihubungkan dengan vibrasi peregangan C=O sepanjang tulang punggung polipeptida atau ikatan hidrogen yang digabungkan dengan COO–, dengan penyerapan kuat dalam kisaran 1600–1700 cm −1 . Pita ini dianggap sebagai indikator paling kritis untuk menentukan struktur sekunder protein (Liu et al. 2014 ; Pati et al. 2010 ). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2 , pita amida I untuk ASC-S dan ASC-C berada pada 1631,48 cm −1 . Ini menunjukkan bahwa protein memiliki struktur sekunder yang terorganisir dengan baik dengan ikatan hidrogen yang kuat. Ini juga menyiratkan tingkat keteraturan molekuler dan stabilitas struktural yang tinggi. Liu et al. ( 2014 ) melaporkan puncak amida I pada sekitar 1650 cm −1 untuk kolagen kulit ikan mas. Pita amida II, yang biasanya diamati dalam rentang 1550–1600 cm −1 , terutama diasosiasikan dengan pembengkokan NH yang dikombinasikan dengan vibrasi peregangan CN. Pergeseran ke panjang gelombang yang lebih rendah di wilayah ini mengindikasikan pembentukan ikatan hidrogen. Dengan kata lain, pita amida II menentukan jumlah gugus NH yang terlibat dalam ikatan hidrogen dengan rantai-α yang berdekatan; oleh karena itu, bilangan gelombang yang lebih rendah dari pita amida II mengindikasikan peningkatan ikatan hidrogen oleh gugus NH, dan tatanan struktur yang lebih tinggi (Woo et al. 2008 ). Bilangan gelombang ASC-S dan ASC-C ditemukan masing-masing sebesar 1547,59 cm −1 dan 1537,95 cm −1 . Berdasarkan hal ini, data saat ini menunjukkan bahwa ASC-C memiliki jumlah ikatan hidrogen yang lebih tinggi dibandingkan dengan ASC-S. ( 2004 ) mengamati puncak amida II pada kisaran 1540–1558 cm −1 untuk kolagen kulit ikan nila. Pita amida III dikaitkan dengan peregangan CN dan pembengkokan NH dan dihubungkan ke struktur heliks rangkap tiga kolagen (Woo et al. 2008 ). Dalam penelitian ini, pita amida III ASC-S dan ASC-C masing-masing terletak pada bilangan gelombang 1236,15 cm -1 dan 1235,18 cm -1 . Hasil penelitian menunjukkan bahwa ikatan hidrogen hadir di ASC-S dan ASC-C. Selain itu, puncak serapan pada 1452,14 cm -1 untuk ASC-S dan 1451,17 cm -1 untuk ASC-C diamati, yang sesuai dengan getaran cincin pirolidina prolin dan hidroksiprolin (Muyonga et al. 2004 ). Rasio intensitas antara pita amida II dan pita 1450 cm −1 telah digunakan untuk memperjelas struktur tiga heliks kolagen (Guzzi Plepis et al. 1996 ). Dalam penelitian ini, rasio penyerapan antara pita amida III (ASC-S pada 1236,15 cm −1 , ASC-C pada 1235,18 cm −1 ) dan pita 1452,14 cm −1 (ASC-S) atau 1451,17 cm −1 (ASC-C) adalah sekitar 1,1. Hal ini menegaskan bahwa struktur tiga heliks dari ASC-S dan ASC-C tetap utuh, dengan tingkat organisasi intermolekul yang tinggi terpelihara (Guzzi Plepis et al. 1996 ).

 

3.4 Kalorimetri Pemindaian
Diferensial Gambar 3 menampilkan suhu transisi maksimum ( T max ) ASC yang diisolasi dari tulang ASC-S dan ASC-C dan dilarutkan dalam asam asetat 0,5 M. ASC-S dan ASC-C ditemukan memiliki nilai T max dan entalpi (∆H) masing-masing sebesar 32,17°C dan 0,111 J/g dan 34,76°C dan 0,417 J/g. Campuran asam amino kolagen, terutama asam imino, memengaruhi stabilitas panasnya. Kolagen ikan telah terbukti memiliki konsentrasi asam imino yang lebih besar ketika suhu denaturasi termal lebih tinggi (Chen et al. 2022 ). Dalam penyelidikan kami, kami menentukan bahwa kandungan asam imino (prolin + hidroksiprolin) ASC-S dan ASC-C masing-masing adalah 27,81% dan 27,65%. Nilai-nilai ini ditemukan oleh Montero et al. ( 1990 ), sementara nilai untuk Nile perch, Salmo irideus , dan Merluccius merluccius dipublikasikan oleh Muyonga et al. ( 2004 ). Temuan kami menunjukkan bahwa suhu denaturasi dan konsentrasi asam imino berkorelasi positif. Nilai T max untuk berbagai sumber kolagen telah dilaporkan dalam sejumlah penelitian, dan telah dihipotesiskan bahwa T max bergantung pada spesies ikan, usia, perubahan terkait usia dalam suhu habitat dan lingkungan, dan musim (Chuaychan et al. 2015 ; Liu et al. 2018 ; Thuy dan Minh 2012 ; Tang et al. 2015 ).

3.5 Difraksi Sinar-X Metode ini mempelajari susunan atom demi atom kolagen menggunakan sinar-X,
yang dapat mengungkapkan detail tentang struktur kristal material tersebut. Kurva XRD untuk ASC-C dan ASC-S menunjukkan puncak refraksi yang jelas pada sudut difraksi (2θ) masing-masing sekitar 7,23° dan 21,53° untuk ASC-S dan 7,57° dan 23,34° untuk ASC-C, seperti yang terlihat pada Gambar 4. Struktur triple helix kolagen dikaitkan dengan puncak tajam pertama, dan jarak antar rantai ditunjukkan oleh puncak lebar kedua (Bella et al. 1994 ). Temuan ini memverifikasi bahwa tidak ada kolagen yang terdenaturasi dan masih memiliki struktur triple helix. Hasil yang sebanding terlihat pada kolagen sisik tiapia (Oreochromis niloticus) (Chen et al. 2016 ), kolagen tulang ikan kadal ( Saurida tumbil ) (Jaziri et al. 2022a ), kolagen tulang ikan unicorn ( Naso reticulatus Randall) (Fatiroi et al. 2023 ), kolagen ikan cod Atlantik, dan kolagen kulit salmon Atlantik (Alves et al. 2017 ).

3.6 Mikroskopi Elektron Pemindaian dan Analisis Kimia Unsur Struktur morfologi kolagen beku-kering yang diekstraksi
(ASC-S dan ASC-C) divisualisasikan melalui SEM dengan perbesaran ×1000 dan ×2000 (Gambar 5A,B ). Ketika dilihat dengan mata telanjang, kedua kolagen tampak seperti spons putih lembut dengan struktur longgar dan berpori. Namun, dalam gambar SEM, multilapisan menunjukkan struktur seperti lembaran yang sebagian berkerut, mungkin karena dehidrasi selama beku-kering, bersama dengan fibril kolagen kompleks yang tidak teratur yang dihubungkan oleh filamen yang dililitkan secara acak. Namun, struktur yang tidak teratur dan tubular juga telah diamati. Demikian pula, Ramanathan et al. ( 2014 ) mengamati struktur lapis demi lapis ASC yang diekstraksi dari kulit Arothron stellatus , dan ini terkait dengan jalinan serat kolagen. Lebih lanjut, Rizk dan Mostafa ( 2016 ), Tziveleka et al. ( 2017 ), Rodrigues et al. ( 2010 ), dan Pal et al. ( 2015 ) menyatakan bahwa gambar SEM dari kolagen yang mereka ekstrak memiliki permukaan yang halus atau sedikit keriput atau struktur seperti lembaran. Karakterisasi kolagen menggunakan SEM/EDS sangat penting dalam menetapkan kemurniannya. Spektrum EDS Gambar 6A,B dari ASC-S dan ASC-C mengungkapkan adanya puncak emas (Au) intensitas rendah yang berasal dari lapisan logam, serta karbon (C), oksigen (O), dan nitrogen (N). Dalam hal ini, kemurnian tinggi kolagen yang dihasilkan ditunjukkan oleh fakta bahwa kedua kolagen hanya terdiri dari komponen C, O, dan N, dan jumlah elemen ini masing-masing adalah C>O>N. Telah dicatat bahwa kondisi pemrosesan, termasuk penggunaan nano-grinding, dapat menyebabkan degradasi sebagian kolagen dengan memengaruhi kelarutan dan integritas strukturalnya. Degradasi ini dapat menyebabkan serat kolagen tampak kurang terorganisir atau terfragmentasi dalam gambar SEM (Li et al. 2020 ).

3.7 Elektroforesis Gel Poliakrilamid–Sodium Dodecyl Sulfate (SDS–PAGE)
Pola elektroforesis gel poliakrilamid-natrium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) dari ASC dari tulang ikan kerapu dan ikan mas ditunjukkan pada Gambar 7. Tiga rantai khas terdeteksi di kedua ASC dari tulang ikan kerapu dan ikan mas: 2 pita α (α1, atas; α2, bawah) dengan berat molekul sekitar 100–130 kDa, dan komponen ikatan silang β-nya, dengan berat molekul di atas 180 kDa. Hal ini sesuai dengan kolagen dari sebagian besar spesies ikan lain yang sebelumnya dilaporkan seperti ikan lele (Abbas 2022 ), ikan air tawar Amazon pirarucu (Carpio et al. 2023 ), ikan pari kukuk, ikan grenadier Atlantik biasa, hiu lentera, hiu kucing, hiu kucing tutul kecil (Sotelo et al. 2016 ), hiu bambu pita coklat (Kittiphattanabawon et al. 2010 ), ikan lele bergaris (Singh et al. 2011 ), ikan kodok punggung coklat (Senaratne et al. 2006 ) dan merupakan ciri khas kolagen tipe I (Ahn et al. 2021 ). Kulit dan tulang ikan dilaporkan mengandung kolagen tipe I sebagai kolagen utama (Liu dan Huang 2016 ; Fatiroi et al. 2023 ; Jaziri et al. 2022a ; Guiry et al. 2016 ; Wijaya 2021 ).

3.8 Analisis Asam Amino
Tabel 1 menunjukkan kandungan asam amino yang identik pada ASC yang diperoleh dari tulang ikan kerapu Eropa (ASC-S) dan ikan mas biasa (ASC-C), kecuali asam glutamat ( p  > 0,05). Pada ASC-S dan ASC-C, glisin masing-masing membentuk 27,54% dan 29,46% dari total kandungan asam amino.
Tiga rantai alfa yang membentuk kolagen melingkar di atas satu sama lain dan mencakup urutan, dengan urutan asam amino berulang dalam bentuk Glycine-XY. Dengan kata lain, menurut Liu et al. ( 2018 ), glisin merupakan sekitar sepertiga dari asam amino dalam kolagen dan hadir di setiap posisi ketiga dalam rantai peptida. Dua sampel kolagen penelitian kami membuktikan hal ini. Dibandingkan dengan kolagen lain, triptofan dan sistin tidak ada, sementara jumlah asam amino lain yang sangat rendah seperti tirosin, valin, dan metionina ditemukan (Jongjareonrak et al. 2005 ; Liu dan Huang 2016 ; Koliada dan Plavan 2015 ).

Stabilitas dan kekuatan triple helix kolagen bergantung pada kuantitas asam imino, yaitu prolin dan hidroksiprolin. Secara spesifik, melalui pembentukan ikatan hidrogen antar rantai, hidroksiprolin sangat penting dalam menjaga stabilitas triple helix (Xu et al. 2019 ). Prolin plus hidroksiprolin membentuk kuantitas total asam imino, yang ditetapkan menjadi 27,81% dan 27,65% untuk ASC-S dan ASC-C, berturut-turut. Hasil ini secara statistik identik ( p  > 0,05). Nilai-nilai ini dilaporkan dalam penelitian oleh Montero et al. ( 1990 ) untuk Salmo irideus dan Merluccius merluccius , dan oleh Muyonga et al. ( 2004 ) untuk Nile perch. Meskipun demikian, mereka ditemukan di dekat nilai yang dilaporkan tilapia sebesar 25,4% (Grossman dan Bergman 1992 ). Hubungan antara konsentrasi asam imino dan stabilitas termal kolagen juga sudah mapan; seperti dicatat oleh Truong et al. ( 2021 ), Kawaguchi et al. ( 2011 ), dan Kiew dan Mashitah ( 2013 ), suhu denaturasi kolagen meningkat dengan kandungan asam imino. Menurut Akita et al. ( 2020 ), kolagen yang diisolasi dari hewan yang hidup di iklim dingin dikatakan memiliki titik leleh yang lebih rendah dan tingkat stabilitas termal yang lebih rendah karena konsentrasi prolin dan hidroksiprolin yang rendah. Selain itu, telah dilaporkan bahwa salah satu penyebab utama suhu denaturasi yang tinggi dalam kolagen komersial yang berasal dari tendon sapi adalah konsentrasi prolin, hidroksiprolin, dan alanin yang tinggi (Le et al. 2020 ). Karena ikan kerapu dan ikan mas adalah ikan iklim hangat, konsentrasi asam imino dari kedua kolagen yang diperoleh dalam penelitian kami diprediksi untuk mereka. Ini membantu menjelaskan mengapa suhu denaturasi ASC-S dan ASC-C lebih tinggi daripada suhu denaturasi ikan iklim dingin (masing-masing 32,17°C dan 34,76°C).

4 Kesimpulan
Ekstraksi kolagen dari limbah pengolahan ikan merupakan cara yang hemat biaya dan berkelanjutan untuk memanfaatkan sumber daya yang kurang dimanfaatkan ini, karena memungkinkan pemulihan protein yang berharga sekaligus mengurangi biaya pembuangan limbah. Tulang ikan mengandung kolagen, meskipun dalam jumlah yang lebih rendah daripada kulit ikan. Akan tetapi, produk sampingan ini lebih melimpah daripada kulit dan oleh karena itu, dapat menjadi sumber kolagen yang penting. Dalam penelitian ini, ekstraksi dan karakterisasi ASC dilakukan dari tulang ikan kerapu Eropa ( Dicentrarchus labrax ) dan ikan mas ( Cyprinus carpio ), yang melimpah di Turki. Telah ditunjukkan bahwa limbah tulang ikan kerapu dan ikan mas merupakan sumber kolagen Tipe 1. Mikrostrukturnya yang berpori dan tidak teratur menunjukkan potensinya untuk digunakan sebagai biomaterial. Oleh karena itu, penelitian di masa mendatang harus difokuskan pada penggunaan kolagen dari produk sampingan tulang ikan kerapu dan ikan mas sebagai alternatif kolagen mamalia dan sebagai bahan yang berharga dan ramah lingkungan dalam aplikasi kosmetik, biofarmasi, biomaterial, dan makanan. Telah diamati juga bahwa lingkungan tempat ikan hidup, seperti air laut atau air tawar, tidak memiliki efek langsung pada sifat kolagen.