Abstrak
Jumlah sel somatik (SCC) adalah uji yang digunakan untuk mengendalikan mastitis pada domba betina, tetapi tidak ada konsensus mengenai nilai batasnya. Penanda mastitis subklinis (SCM) lainnya telah diusulkan sebagai penanda yang berpotensi lebih efisien, sensitif dan spesifik, seperti jumlah sel somatik diferensial (DSCC). Beberapa penelitian telah dilakukan pada aplikasi DSCC susu sapi, terutama sejak pengembangan metode (metode Foss DSCC) yang memungkinkan penentuan SCC dan DSCC secara cepat dan simultan dalam susu sapi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki metode Foss DSCC dalam susu domba betina. Pertama-tama kami menghitung batas SCC untuk sampel susu setengah ambing domba dari tiga ras sapi perah yang akan digunakan dengan analisis bakteriologis untuk menentukan SCM; kedua, kami memvalidasi metode Foss DSCC setelah validasi yang dilakukan pada susu sapi; dan akhirnya, studi batas DSCC dilakukan untuk susu SCM domba. Untuk tujuan ini, 4074 sampel susu setengah ambing induk domba dari tiga ras dianalisis untuk penyelidikan bakteriologis, SCC, dan DSCC. Validasi metode Foss DSCC mengikuti yang sebelumnya dilakukan pada susu sapi, sedangkan nilai batas optimal dipilih berdasarkan metode Youden setelah membuat kurva karakteristik operasi penerima dan menghitung nilai area relatif di bawah kurva. Spesifisitas, pengulangan, dan ketahanan metode Foss DSCC untuk susu domba sebanding dengan metode untuk susu sapi. Batas optimal menghasilkan 500 × 10 3 sel/mL dan 71,5% untuk SCC dan DSCC, masing-masing. Untuk pertama kalinya, metode Foss DSCC divalidasi dalam susu domba, dan nilai batas SCC dan DSCC ditentukan untuk tiga ras susu perah induk domba yang penting di Italia. Hasil ini akan memungkinkan pengembangan studi lebih lanjut untuk meningkatkan skrining mastitis dan akan membantu petani, dokter hewan, dan teknisi untuk mengidentifikasi SCM dalam kawanan.

PERKENALAN
Meskipun domba hanya menyediakan 1% dari susu dunia (Libera et al . 2021 ), mereka memainkan peran penting dalam ekonomi peternakan di beberapa negara, termasuk Tiongkok, produsen terbesar dunia, Yunani, Rumania, dan Italia di Eropa, serta negara-negara Timur Dekat dan Afrika Utara (Balthazar et al . 2017 ). Spesies ini dianggap menguntungkan, terutama di Mediterania dan Negara-negara Ketiga, karena biaya produksi yang relatif rendah dan investasi modal yang diperlukan untuk peternakan domba, tetapi sangat cocok dengan gagasan pertanian organik di negara-negara yang sangat terindustrialisasi (Libera et al . 2021 ). Konsumsi susu domba tidak umum, sementara itu merupakan matriks yang sangat baik untuk produksi keju karena kadar protein, lemak, dan kalsiumnya yang tinggi dari unit kasein (Balthazar et al . 2017 ).

Kualitas dan kebersihan produksi ternak merupakan hal yang wajib untuk komersialisasinya. Untuk susu, baik kualitas maupun kebersihan dapat dievaluasi melalui jumlah sel somatik (SCC) (Fadillah et al . 2023 ). Sel somatik sebagian besar terdiri dari sel inflamasi, seperti limfosit, makrofag, dan polimorfonukleat (PMN), yang berperan penting dalam pertahanan kelenjar susu (Kaskous et al . 2023 ). Penurunan status kesehatan ambing, seperti infeksi intramammary, menyebabkan peningkatan SCC, karena kerusakan jaringan dan pelepasan berbagai senyawa kemoatraktan ke dalam sistem susu yang menarik sel inflamasi dari aliran darah (Alhussein dan Dang 2018 ). Hal ini memiliki efek negatif terkait pada kualitas susu, seperti sifat koagulasi, hasil dadih, dan kualitas keju (Libera et al . 2021 ). Namun, SCC yang tinggi tidak hanya merupakan masalah kualitas susu tetapi juga menunjukkan masalah kesehatan ambing, seperti adanya infeksi ambing karena patogen zoonosis dengan risiko bagi konsumen, yang memengaruhi kebersihan susu (Fadillah et al . 2023 ; Schadt 2023 ). Oleh karena itu, mastitis tidak hanya menjadi salah satu masalah kesehatan dan kesejahteraan yang paling relevan pada ruminansia perah tetapi juga yang paling mahal pada domba (Libera et al . 2021 ). Namun, pada mastitis subklinis (SCM), tidak ada susu, ambing atau kelainan sistemik yang dapat diamati, tetapi ada peningkatan nilai SCC (Libera et al . 2021 ). Oleh karena alasan ini, SCC merupakan penanda penting SCM, tetapi tidak ada konsensus mengenai nilai batas untuk susu domba yang dapat membedakan antara ambing yang sehat dan yang terkena SCM (Libera et al . 2021 ). Tingkat SCC fisiologis yang dilaporkan dalam literatur untuk susu domba yang sehat masih kontroversial, dengan minimum 10 hingga maksimum 1000 × 103 sel /mL (Libera et al . 2021 ). Hal ini dapat terjadi karena beberapa faktor lain dapat memengaruhi nilai SCC pada spesies ini, seperti usia, paritas, ras, sistem manajemen, jumlah domba yang lahir, tahap laktasi fisiologis, dan musim (Libera et al . 2021 ).

Karena keterbatasan SCC saat ini, penanda SCM lainnya telah diusulkan sebagai penanda yang berpotensi lebih efisien, sensitif, dan spesifik (Libera et al . 2021 ). Di antara penanda-penanda tersebut, hitungan sel somatik diferensial (DSCC) telah diselidiki khususnya untuk susu sapi (Huang et al . 2023 ). Beberapa penelitian telah dilakukan pada aplikasi DSCC susu sapi (Bobbo et al . 2020 ; Schwarz et al . 2020a , 2020b ; Huang et al . 2023 ; Magro et al . 2023 ), khususnya sejak pengembangan metode (metode Foss DSCC) yang memungkinkan penentuan SCC dan DSCC secara cepat dan simultan dalam susu sapi (Damm et al . 2017 ). Alat ini adalah metode fluor optik yang menunjukkan hasil yang murah, andal, dapat diulang, dan berthroughput tinggi (Damm et al . 2017 ). Metode Foss DSCC dapat secara otomatis menghitung persentase PMN dan limfosit pada SCC, sementara makrofag dapat dihitung dengan mengurangi DSCC dari 100% (Damm et al . 2017 ).

Meskipun penggunaan metode Foss DSCC secara rutin digunakan untuk analisis SCC susu domba, karena validasi dilakukan melalui uji kecakapan antarlaboratorium, tidak ada validasi yang dilakukan pada DSCC dalam susu domba. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki metode Foss DSCC dalam susu domba betina untuk membedakan antara ambing yang sehat dan yang terkena SCM. Untuk tujuan ini, pertama-tama kami menghitung batas SCC untuk sampel susu domba setengah ambing dari tiga ras sapi perah yang akan digunakan dengan analisis bakteriologis untuk menentukan SCM; kedua, kami memvalidasi metode Foss DSCC setelah validasi yang dilakukan pada susu sapi; dan akhirnya, penelitian batas DSCC dilakukan untuk susu domba SCM.

BAHAN DAN METODE
Hewan
Studi ini disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee, Universitas Pisa (N: 11/2021 tanggal 19.03.2021). Sepuluh peternakan, yang terletak di provinsi Grosseto dan Siena di Tuscany, Italia, disertakan dalam studi ini. Kriteria inklusi peternakan adalah sebagai berikut: (1) mereka memiliki kawanan sapi perah Lacaune, Sarda, atau Comisana dalam sistem peternakan sapi perah semi-intensif, (2) mereka memiliki riwayat SCC susu massal di atas 106 sel /mL rata-rata selama tahun lalu, yang merupakan batas tertinggi yang digunakan dalam literatur untuk membedakan antara domba yang sehat dan mastitis (Kaskous et al . 2023 ) (3) mereka secara historis bebas Mycoplasma agalactiae dan (4) mereka divaksinasi untuk Staphylococcus aureus . Antara tahun 2021 dan 2022, sampel susu setengah ambing domba betina dikumpulkan dari 2037 hewan. Pada saat pengambilan sampel susu, semua hewan yang disertakan dalam penelitian ini diperah dua kali sehari, tidak menunjukkan tanda-tanda mastitis klinis, dan semuanya sehat berdasarkan pemeriksaan klinis yang dilakukan oleh dokter hewan setempat.

Sampel susu
Sebelum pengambilan sampel, ujung puting dibersihkan dan didisinfeksi dengan disinfektan berbasis klorheksidin komersial, dan aliran pertama susu depan dibuang. Dua bagian sekitar 40 mL susu dikumpulkan dari setiap setengah ambing dalam tabung plastik steril dan tiba-tiba didinginkan pada suhu 4°C dalam kotak khusus. Bagian pertama dari sampel susu dianalisis untuk kultur bakteri, sedangkan bagian kedua dianalisis untuk SCC dan DSCC. Secara kontekstual terhadap analisis SCC dan DSCC, slide untuk pemeriksaan jumlah sel diferensial mikroskopis dilakukan. Semua analisis dilakukan oleh laboratorium Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e della Toscana, Grosseto, Italia, dalam waktu 12 jam setelah panen. Laboratorium tersebut terakreditasi menurut UNI CEI EN ISO/IEC 17025. Sampel susu domba massal, yang dianalisis secara rutin oleh laboratorium, digunakan untuk uji pengulangan validasi metode Foss DSCC pada domba perah.

Pemeriksaan Bakteriologis
Sampel susu dikultur mengikuti prosedur standar (Adkins dan Middleton 2018 ). Secara singkat, 10 mikroliter sampel susu diambil dengan loop yang disterilkan dan ditanam pada media agar darah dan diinkubasi pada suhu 37°C dalam kondisi aerobik. Plat diperiksa setelah 24 dan 48 jam untuk pertumbuhan bakteri. Isolasi setidaknya 10 koloni dengan jenis yang sama dianggap signifikan sebagai bakteriologis positif, sedangkan isolasi tiga atau lebih jenis koloni dianggap sebagai hasil kontaminasi lingkungan, dan sampel dieliminasi dari penelitian. Koloni bakteri yang berkembang diperiksa untuk analisis taksonomi: karakteristik morfologi koloni bakteri, pewarnaan Gram, dan hasil oksidase dan katalase dipertimbangkan. Kokus Gram-positif disaring untuk aktivitas katalase, pertumbuhan pada Baird Parker Agar Base + RPF Supplement dan Modified Edwards Medium.

Penentuan jumlah sel somatik
Penentuan SCC dalam sampel susu setengah ambing dilakukan melalui metode fluoro-opto-elektronik dengan instrumen Fossomatic 7 DC (Foss Electric, Hillerød, Denmark) sesuai dengan ISO UNI EN ISO 13366 (2006).

Penentuan SCC dalam sampel susu setengah ambing dilakukan melalui metode fluoro-opto-elektronik menggunakan instrumen Fossomatic 7 DC (Foss Electric, Hillerød, Denmark) sesuai dengan UNI EN ISO 13366 (2006) di laboratorium Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana, yang diakreditasi oleh Accredia, Badan Akreditasi Italia (Laboratorium No. 0201A).

Analisis SCC susu domba curah dengan instrumen Fossomatic 7 DC rutin digunakan laboratorium karena sebelumnya telah divalidasi melalui uji profisiensi dua tahunan yang diselenggarakan oleh organisme independen (Associazione Italiana Allevatori Laboratorio Standard Latte, AIA, web site http://www.aia.it/lsl/index.htm ) mengikuti UNI CEI EN ISO/IEC 17043 dan ISO 13528 e/o UNI ISO 5725-2, dan uji profisiensi susu domba yang diselenggarakan oleh Centro di Referenza Nazionale per la qualità del latte e dei prodotti derivati ​​degli ovini e dei caprini (C.Re.LDOC, IZSLT, Rome) yang diselenggarakan pada tahun 2021 (data tidak ditampilkan). Sampel yang menunjukkan pemisahan baik (GOSE) kurang dari 1 pada metode fluoro-opto-elektronik dengan instrumen Fossomatic 7 DC dieliminasi dari penelitian.

Validasi metode Foss DSCC untuk susu domba
Penentuan DSCC dalam sampel susu setengah ambing dilakukan melalui metode fluoro-opto-elektronik dengan instrumen Fossomatic 7 DC (Foss Electric, Hillerød, Denmark). Untuk mengevaluasi spesifisitas metode Foss DSCC, hubungan dengan metode referensi internal lain untuk diferensiasi sel diselidiki. Secara singkat, 250 sampel susu individu dipilih secara kasual dan dioleskan pada slide mikroskopis pada saat yang sama dengan analisis Foss DSCC. Apusan susu dilakukan dengan mengikuti metode Paape et al . ( 1963 ) dan Petersson et al . ( 2011 ) yang dimodifikasi (Petersson et al . 2011 ; Paape et al . 1963 ). Sampel diaduk dengan mengocok 25 kali dalam 7 detik dengan gerakan sekitar 30 cm, dan kemudian 0,01 mL susu dipindahkan melalui loop steril ke slide mikroskop dan didistribusikan lebih dari satu sentimeter persegi. Apusan dikeringkan di udara selama 24 jam pada permukaan datar dan dihilangkan lemaknya dengan alkohol etil 96%. Kaca objek diwarnai menggunakan pewarna hematologi (Hemacolor®, Merck KGaA, Darmstadt, Jerman), dan 100 sel per kaca objek diidentifikasi sebagai nukleat polimorf, limfosit atau makrofag pada perbesaran 100x dan dihitung seperti yang dijelaskan oleh Pongrácz dan Iváncsics ( 2007 ). Koefisien korelasi Pearson ( r ) dihitung untuk menyelidiki hubungan antara kedua metode menggunakan paket perangkat lunak R.

Untuk menghitung pengulangan metode Foss DSCC, 16 sampel komposit domba yang tersedia secara rutin dianalisis dalam 10 kali pengulangan, dan nilai rata-rata dan simpangan baku dihitung. Ketahanan metode diselidiki dengan mempertimbangkan efek variabilitas sampel pada pemisahan antara sel dan latar belakang matriks susu dalam plot titik yang diperoleh dari sampel yang dianalisis untuk DSCC. Persentase sampel dengan GOSE kurang dari 1 dihitung.

Statistik
Prevalensi dan interval kepercayaan 95% (CI 95%) dari bakteri yang diisolasi dalam SCM dihitung.

Untuk menghasilkan kurva receiver operating Characteristics (ROC) dan menghitung nilai terkait dari area under the curve (AUC), sensitivitas (Se), spesifisitas (Sp), nilai prediktif positif (PPV), nilai prediktif negatif (NPV), nilai cut-off optimal dan interval kepercayaannya (95% CI), digunakan perangkat lunak statistik easyROC versi 1.3.1 untuk analisis kurva ROC. Nilai cut-off SCC dipilih berdasarkan metode Youden, dengan mempertimbangkan SCM ketika kultur bakteriologis positif, seperti yang dilaporkan dalam literatur (Clements et al . 2003 ; Riggio et al . 2013 ; Persson et al . 2017 ). Interpretasi AUC didasarkan pada uji 0,9 ≤ AUC sangat baik, uji 0,8 ≤ AUC < 0,9 cukup, uji 0,7 ≤ AUC < 0,8 cukup, uji 0,6 ≤ AUC < 0,7 buruk dan uji 0,5 ≤ AUC < 0,6 gagal (Çorbacıoğlu dan Aksel 2023 ).

Berdasarkan uji normalitas Shapiro–Wilk, data SCC dan DSCC mengikuti distribusi non-normal. Oleh karena itu, uji Mann–Whitney nonparametrik diterapkan, menggunakan perangkat lunak R, untuk menyelidiki perbedaan statistik nilai median SCC antara setengah ambing yang menunjukkan hasil negatif kultur bakteriologis (sehat) dan yang positif (terkena SCM) (Tim Inti R 2021 ). Sementara untuk nilai median DSCC, uji Mann–Whitney nonparametrik diterapkan, menggunakan perangkat lunak R, untuk menyelidiki perbedaan statistik antara setengah ambing yang menunjukkan hasil negatif (Tim Inti R 2021 ). Dalam kasus ini, hasil kultur bakteriologis (negatif atau positif secara bakteriologis), nilai SCC yang dihitung (di bawah atau sama atau di atas nilai batas SCC), dan irisan kedua hasil (negatif secara bakteriologis dan di bawah atau sama dengan nilai batas SCC atau positif secara bakteriologis dan di atas nilai batas SCC) digunakan untuk membedakan antara yang sehat dan yang terkena sampel SCM. Nilai batas DSCC dipilih berdasarkan metode Youden untuk diskriminan yang sama yang digunakan sebagai uji baku emas (hasil kultur bakteriologis, nilai batas SCC yang dihitung, dan irisan kedua hasil) menggunakan alat web untuk analisis kurva ROC easyROC.

HASIL
Dari 10 peternakan domba perah yang dilibatkan, tiga peternakan mengembangbiakkan domba betina Sarda, empat domba Lacaune, dan tiga domba Comisana. Secara keseluruhan, 613 domba Sarda, 501 domba Lacaune, dan 923 domba Comisana terlibat.

Sebanyak 4074 sampel susu dari setengah ambing dikumpulkan dan dianalisis. Dari pemeriksaan bakteriologis, 2851 sampel diuji negatif dan 1053 diuji positif untuk satu atau dua bakteri (30,46%, CI 95% 29,05–31,87). Prevalensi tertinggi sampel positif diamati pada domba Sarda (42,33% CI 95% 39,57–45,10) diikuti oleh Lacaune (27,35%, CI 95% 24,59–30,11) dan ras Comisana (24,27%, CI 95% 22,31–26,22) (Tabel 1 ). Bakteri yang paling representatif teridentifikasi adalah Gram positif di semua ras, dengan prevalensi 28,86% (Lacaune: 26,05%; Sarda: 23,24%; Comisana: 23,24%). Khususnya, Staphylococcus spp. merupakan bakteri yang paling banyak diisolasi di semua ras, diikuti oleh Streptococcus spp. dan bakteri Gram-negatif, dengan perbedaan tergantung pada ras (Tabel 1 ). Di antara Staphylococcus spp., nonaureus staphylococci (NAS) merupakan bakteri yang paling representatif (22,04%).

Secara keseluruhan, 3552 sampel (2633 negatif, 919 positif) dipertimbangkan untuk analisis statistik SCC, menghasilkan GOSE 1 dan tidak ada kontaminasi oleh bakteri lingkungan (negatif atau positif pada pemeriksaan bakteriologis) dan dengan jumlah yang dapat dianalisis oleh instrumen. Nilai median SCC dari sampel negatif adalah 131,00 × 103 sel /mL, sedangkan untuk sampel positif, adalah 1068,00 × 103 sel /mL; ada perbedaan yang signifikan secara statistik untuk nilai median SCC antara setengah ambing yang menunjukkan hasil negatif kultur bakteriologis (sehat) dan yang positif (terkena SCM) (Tabel 2 ). Bahkan jika jumlah sampel yang dianalisis berbeda, rata-rata SCC dalam sampel negatif serupa di ketiga ras. Sebaliknya, rata-rata SCC dalam sampel positif lebih rendah pada ras Comisana (619,50 × 103 sel /mL), yang jumlah sampelnya dianalisis lebih banyak, dibandingkan pada dua ras lainnya. Namun, perbedaan signifikan hasil SCC antara sampel bakteriologis negatif dan positif diamati pada ketiga ras tersebut

Nilai batas SCC yang dihitung dengan analisis ROC untuk seluruh populasi untuk membedakan antara ambing setengah sehat dan SCM adalah 500 × 103 sel /mL, dengan nilai AUC wajar (0,753) dan Se dan Sp masing-masing 0,665 dan 0,807 (Tabel 3 ). Mempertimbangkan ras, Lacaune menunjukkan batas 501 × 103 sel /mL, dengan nilai AUC cukup (0,850), Sarda menunjukkan batas 468 × 103 sel /mL, dengan AUC wajar 0,778 (cukup), dan Comisana memiliki batas 500 × 103 sel /mL, dengan AUC buruk 0,671. Semua hasil untuk AUC, Se, Sp, PPV dan PNV dilaporkan dalam

Untuk memeriksa hubungan antara metode Foss DSCC dan metode mikroskopis setelah pewarnaan hematologi untuk diferensiasi sel, dari 250 apusan yang dilakukan, 198 sampel yang memiliki nilai SCC antara 50 dan 1500 × 103 sel /mL diperiksa melalui dua metode yang digunakan (100 sampel Lacaune, 48 sampel Sarda dan 50 sampel ras Comisana) mengikuti validasi Damm et al . ( 2017 ) (masing-masing, Gambar 1a–d ). Koefisien r Pearson adalah 0,700 ( P  < 0,00001) mempertimbangkan semua sampel yang dianalisis, 0,723 ( P  < 0,00001) untuk sampel Lacaune, 0,815 ( P  < 0,00001) untuk sampel Sarda, dan 0,566 ( P  < 0,00002) untuk sampel Comisana.
Kemampuan mengulang ditentukan dengan analisis 16 sampel komposit domba yang tersedia secara rutin, dijalankan dalam 10 replikasi. Sampel dengan SCC berkisar dari 118 × 10 3 hingga 1273 × 10 3 sel/mL dan DSCC dari 53,89% hingga 83,71% mewakili set data yang dipertimbangkan. Semua sampel menunjukkan kemampuan mengulang yang dapat diterima (SD minimum 0,55 maksimum 2,17), dan simpangan baku rata-rata adalah 1,15. Kekokohan khusus metode diuji pada 3953 sampel dari tiga ras yang dipertimbangkan, dengan SCC berkisar dari 50 hingga 81 141 × 10 3 sel/mL. Seperti yang dijelaskan oleh Damm et al . ( 2017 ), meskipun rasio signal-to-noise yang lebih rendah mungkin masih memberikan DSCC yang sebanding, hal itu mungkin membuat metode tersebut kurang kuat (Damm et al . 2017 ). Oleh karena itu, pemisahan antara sinyal sel dan sinyal latar belakang dari sampel yang dianalisis dievaluasi. Di antara 3953 sampel yang dianalisis dengan Fossomatic 7 DC, 258 sampel setengah ambing menunjukkan GOSE = 0, dengan persentase 6,53% dari total sampel. Dengan mempertimbangkan ras, sampel Lacaune menunjukkan persentase GOSE = 0 sebesar 3,35% (33/936), Sarda sebesar 6,08% (74/1218) dan Comisana sebesar 8,63% (151/1749).

Secara keseluruhan, 2465 sampel susu setengah ambing dengan kisaran 50 hingga 1500 × 103 sel /mL susu (658 sampel susu setengah ambing Lacaune, 714 Sarda dan 1093 Comisana) dipertimbangkan untuk analisis statistik lebih lanjut DSCC. Hasil dianalisis dengan mempertimbangkan hasil kultur bakteriologis atau nilai batas SCC yang diperoleh sebelumnya untuk membedakan antara setengah ambing sehat dan SCM (Tabel 4 ). Ketika kultur bakteriologis dianggap sebagai standar emas, nilai median DSCC adalah 65–40% untuk sampel negatif dan 72–75% untuk sampel positif, dengan perbedaan yang sangat signifikan ketika mempertimbangkan seluruh pengambilan sampel. Namun, hasil serupa diperoleh hanya pada ras Lacaune, di mana sampel negatif menunjukkan nilai DSSC sebesar 69,30% dan sampel positif 80,50%, dengan perbedaan yang sangat signifikan. Sebaliknya, pada ras Sarda dan Comisana, tidak ada perbedaan statistik yang diamati dalam nilai DSCC antara kelompok bakteriologis negatif dan positif. Ketika batas 500 × 103 sel /mL digunakan untuk mengidentifikasi sampel SCM, perbedaan statistik diamati pada semua ras, dan median DSCC adalah 78,00% dalam sampel SCM. Perbedaan signifikan juga diamati ketika irisan hasil estimasi batas kultur bakteriologis dan SCC (500 × 103 sel /mL) digunakan untuk mengidentifikasi sampel SCM. Namun, dalam kasus ini, pada ras Sarda, perbedaan statistik lebih rendah ( P  < 0,05). Nilai batas optimal dan AUC, Se, Sp, PPV dan NPV dari DSCC menggunakan hasil kultur bakteriologis atau batas terhitung SSC sebagai baku emas, atau irisan kedua hasil tersebut dilaporkan dalam Tabel 5. Nilai batas berkisar dari 68,1% hingga 75,1%. Dengan mempertimbangkan semua sampel, nilai batas adalah 71,2% menggunakan hasil kultur bakteriologis atau batas terhitung SCC, dan irisan kedua hasil, tetapi nilai AUC lebih tinggi (0,77) hanya ketika batas terhitung SCC atau hasil irisan digunakan sebagai uji baku emas untuk mengidentifikasi SCM. Nilai batas terendah diamati pada ras Sarda (68,1%), ketika kultur bakteriologis dianggap sebagai baku emas dengan nilai AUC yang buruk (0,51). Namun, ketika SCC >500 × 103 sel/mL atau irisan kedua hasil digunakan sebagai pembeda SCM pada ras ini, nilai AUC yang dihasilkan cukup (0,63) dan nilai batasnya masing-masing adalah 73,6% dan 73,3%. Akhirnya, batas yang diamati pada ras Comisana menggunakan hasil bakteriologis sebagai standar emas atau irisan dengan nilai batas SCC yang diperkirakan sama dengan yang diamati pada seluruh sampel (71,2%), tetapi AUC yang dihasilkan masing-masing adalah gagal (0,59) dan cukup (0,85).

DISKUSI
Menurut literatur (Alekish dan Alshehabat 2014 ; Świderek et al . 2016 ; Zafalon et al . 2016 ), bakteri yang paling umum diisolasi dalam penelitian ini adalah NAS (22,04%) (Tabel 1 ), yang sudah dianggap sebagai patogen utama yang menyebabkan SMC pada domba (Onni et al . 2010 ; Ozenc et al . 2011 ; Vasileiou et al . 2019 ).

Baru-baru ini, dua tinjauan menyertakan studi yang mencoba menetapkan nilai batas SCC untuk menentukan tingkat fisiologis atau tingkat SCM dalam susu domba dalam literatur (Libera et al . 2021 ; Kaskous et al . 2023 ). Meskipun topik ini banyak dibahas dalam literatur, kedua tinjauan sepakat bahwa nilai ambang batas yang jelas belum ditetapkan; dengan demikian, nilai batas masih dalam pembahasan (Libera et al . 2021 ; Kaskous et al . 2023 ). Selain itu, di antara studi yang menyelidiki nilai batas SCC dalam susu domba, sangat sedikit yang mengevaluasinya berdasarkan analisis kurva ROC yang menghitung nilai terkait AUC (Clements et al . 2003 ; Riggio et al . 2013 ; Alekish and Alshehabat 2014 ; Świderek et al . 2016 ; Zafalon et al . 2016 ); beberapa di antaranya dilakukan pada domba penghasil daging (Clements et al . 2003 ; Zafalon et al . 2016 ). Seperti dalam penelitian kami, dalam sebagian besar penelitian, nilai batas SCC diselidiki dengan menilai kasus SCM menggunakan status bakteriologis sebagai standar emas atau titik referensi (Clements et al . 2003 ; Świderek et al . 2016 ; Zafalon et al . 2016 ; Persson et al . 2017 ).

Dalam literatur, terkait dengan ras, beberapa penelitian menunjukkan nilai fisiologis SCC yang berbeda dengan rentang yang luas (dari 39 hingga 1600 × 103 sel /mL) dalam susu domba betina (Kaskous et al . 2023 ). Kami menyelidiki tiga ras domba perah yang berbeda yang umum di wilayah penyelidikan untuk menentukan batas SCC dan DSCC yang akan digunakan untuk membedakan antara susu yang sehat dan yang terkena SCM. Menggunakan instrumen Fossomatic 7 DC setelah analisis SCC yang sebelumnya divalidasi pada susu domba, nilai batas SCC sebesar 500 × 103 sel /mL diperkirakan dalam seluruh pengambilan sampel, tetapi hasil yang sangat mirip ditemukan pada ketiga ras sapi perah yang dipertimbangkan (501 × 103 sel /mL untuk Lacaune, 468 × 103 sel/mL untuk Sarda, dan 500 × 103 sel /mL untuk Comisana). Hasil-hasil ini sesuai dengan penelitian serupa pada domba perah Valle del Belice ketika seluruh sampel atau sampel yang positif patogen minor dipertimbangkan, dan ambang batas SCC diperkirakan sebesar 645 × 10 3 sel/mL dengan AUC masing-masing sebesar 0,75 dan 0,73 (Riggio et al . 2013 ). Hasil yang serupa dengan penelitian kami juga dilaporkan pada ras-ras penghasil daging Swedia dengan batas 513,5 dan 414,5 × 10 3 sel/mL, masing-masing untuk susu sapih dan setelah melahirkan (Persson et al . 2017 ). Meskipun sedikit perbedaan dalam nilai batas SCC dapat dipengaruhi oleh ras yang diselidiki, sebagaimana dibuktikan juga pada ras Sarda dalam penelitian saat ini (468 × 103 sel /mL), batas 500 × 103 sel /mL dapat menjadi nilai yang dapat diterima untuk membedakan antara susu sehat dan susu SCM pada domba betina. Hasil ini juga dikonfirmasi oleh uji AUC yang menghasilkan cukup (0,753) untuk seluruh pengambilan sampel dan cukup besar (0,848) untuk ras Lacaune. Sp lebih tinggi daripada Se, dengan pengecualian ras Lacaune, di mana Se dan Sp yang sangat mirip diamati (masing-masing 0,855 dan 0,820). Namun, nilai batas dengan Sp yang baik dapat berguna dalam konteks pengobatan atau pemusnahan domba dengan SCM dengan kesadaran akan risiko hasil negatif palsu (Zafalon et al . 2016 ). Bagaimanapun, perbedaan signifikan secara statistik yang tinggi ( P  < 0,001) untuk nilai SCC antara setengah ambing sehat dan yang terkena SCM diamati dalam penelitian ini seperti yang dilaporkan sebelumnya oleh Persson et al . ( 2017 ).

Dalam penelitian ini, dua bagian susu sebanyak 40 mL dikumpulkan, jika memungkinkan, dari setengah ambing tiga jenis domba perah, setelah aliran pertama susu depan dibuang. Bagian pertama digunakan untuk pemeriksaan bakteriologis, sedangkan bagian kedua digunakan untuk pemeriksaan SCC dan DSCC. Pada sapi, nilai SCC yang berbeda diamati antara susu sisterna dan susu alveolar di ambing (Sarikaya dan Bruckmaier 2006 ). Hal ini mungkin telah mempengaruhi analisis, tetapi tidak seperti sapi, domba memiliki kapasitas sisterna yang lebih besar, dan kontribusi susu sisterna terhadap total susu ambing pada ras Lacaune adalah 68%, dengan kisaran 47–77%, sedangkan pada ras Sarda, nilainya berkisar dari 76,8% hingga 84,89% untuk bagian kiri dan kanan ambing, masing-masing (Labussière 1988 ; Nudda et al . 2000 ; Rovai et al . 2008 ). Mempertimbangkan hal itu, susu yang dianalisis adalah susu sisterna, tetapi pada susu domba perah, tidak ada perbedaan nilai SCC yang diamati antara susu sisterna dan susu alveolar ketika diperah dengan interval hingga 12 jam, seperti domba betina dalam penelitian ini yang diperah dua kali sehari (Castillo et al . 2008 ). Pada tahun 2017, Damm dan rekan-rekannya memperkenalkan teknik baru untuk membedakan sel-sel somatik secara bersamaan dengan pengukuran SCC melalui metode Foss DSCC (Damm et al . 2017 ). Metode ini divalidasi dalam susu sapi perah dan dibandingkan dengan metode lain (Damm et al . 2017 ). Metode yang digunakan sebagai standar emas untuk menghitung spesifisitas uji DSCC adalah metode internal yang dikembangkan menggunakan mikroskopi fluoresensi yang menunjukkan korelasi koefisien r  = 0,8456 ( P  < 0,001) dengan metode FOSS DSCC ketika diterapkan pada 180 sampel komposit sapi yang tersedia secara rutin (Damm et al . 2017 ). Tidak ada korelasi ( r  = 0,3520, P  = 0,0532) yang diamati dengan metode mikroskop cahaya setelah sentrifugasi dan pewarnaan hematologi pada 35 sampel komposit sapi, sedangkan korelasi r  = 0,8051 ( P  < 0,001) diamati dengan metode internal yang dikembangkan menggunakan mikroskop fluoresensi (Damm et al . 2017).). Sekalipun metode Foss DSCC hanya divalidasi untuk sampel susu sapi, instrumen Fossomatic 7 DC juga mampu memberikan nilai DSCC untuk susu spesies sapi perah lainnya. Sejauh pengetahuan kami, belum ada penelitian yang mengevaluasi penerapan metode Foss DSCC pada susu domba. Langkah pertama proyek kami adalah mengevaluasi spesifisitas metode Foss DSCC pada susu domba, membandingkan metode ini dengan pemeriksaan mikroskop cahaya, setelah pewarnaan hematologi, sebagaimana dijelaskan sebelumnya dalam literatur (Pongrácz dan Iváncsics 2007 ), pada 198 sampel susu domba setengah ambing. Korelasi antara kedua metode yang dihitung dalam penelitian ini dalam keseluruhan pengambilan sampel lebih rendah ( r  = 0,700, P  < 0,00001) daripada korelasi yang diamati dalam sampel susu sapi menggunakan pemeriksaan mikroskop fluoresensi (Damm et al . 2017 ). Namun, ketika ras dipertimbangkan, korelasi berkisar dari 0,815 ( P  < 0,00001) untuk sampel Sarda hingga 0,566 ( P  < 0,00002) untuk sampel Comisana. Korelasi yang diamati dalam sampel Sarda ( n  = 48) sesuai dengan korelasi yang diamati dalam 35 sampel susu sapi menggunakan metode mikroskopi fluoresensi (Damm et al . 2017 ). Dalam sampel sapi, korelasi dengan metode mikroskopi cahaya yang diamati dalam studi Damm et al . ( 2017 ) jauh lebih rendah daripada korelasi kami dalam semua sampel ras yang diperiksa (Damm et al . 2017 ). Dalam metode mikroskopi cahaya yang dipilih dalam studi kami , tidak ada sentrifugasi dan pencucian sel yang diterapkan; ini dapat menjelaskan perbedaan yang diamati. Sentrifugasi dan pencucian sel diketahui dapat mengubah distribusi jenis sel yang terjadi dalam susu, seperti yang juga dilaporkan oleh Damm et al . Korelasi yang lebih rendah pada susu ras Comisana ( r  = 0,566, P  < 0,00002) dan Lacaune ( r  = 0,723, P  < 0,00001) yang diamati sehubungan dengan ras Sarda ( r  = 0,815, P  < 0,00001) dalam penelitian ini dapat disebabkan oleh komposisi lemak susu dari ras-ras ini. Ketiga ras yang dipertimbangkan dalam penelitian ini diketahui berbeda dalam kandungan lemak susu (Pulina et al . 2005 ). Dalam literatur, kandungan lemak rata-rata Sarda, Lacaune, dan Comisana dilaporkan masing-masing sebesar 6,69%, 7,14%, dan 7,5–10,6% (Pulina et al . 2005 ). Dalam pemeriksaan mikroskopi susu, kandungan lemak rata-rata dapat membuat pembacaan sulit dilakukan (Moraesdkk . Bahkan jika korelasinya signifikan dalam semua sampel susu ras berbeda yang dianalisis, korelasi yang lebih rendah yang diamati dalam susu ras Lacaune dan Comisana tampaknya menurun dengan peningkatan komposisi lemak dari ras susu ini. Pengulangan yang diamati untuk susu domba dalam penelitian ini dapat diterima untuk semua sampel yang diperiksa ( n = 16  ) dan menunjukkan SD rata-rata (1,15) lebih rendah daripada yang diamati dalam susu sapi (2%) oleh Damm dkk . Dalam sampel susu domba yang dianalisis dalam penelitian ini, persentase 6,53% sampel menunjukkan GOSE = 0, dengan rentang dari 3,35% hingga 8,63% tergantung pada rasnya. Kekokohan metode Foss didasarkan pada pemisahan antara sinyal latar belakang dan sinyal sel, yang disebut GOSE (Damm dkk . 2017 ). Selama metode Foss pada 655 sampel susu sapi individu dengan faktor variabel seperti musim, wilayah, negara, manajemen kawanan sapi perah, ras, dan sebagainya, tidak ada kesulitan yang diamati (Damm et al . 2017 ). Namun, GOSE = 0 juga diamati dalam penelitian pada susu sapi oleh Shwarz et al . ( 2020a , 2020b ) dan Magro et al . ( 2023 ), melaporkan variabilitas sampel dengan GOSE = 0 dari 0,04% hingga 0,55%. Dalam penelitian saat ini, persentase yang lebih tinggi yang diamati dalam susu domba dapat dipengaruhi oleh nilai SCC yang tinggi dari beberapa sampel yang dianalisis yang menunjukkan median (±SD) sebesar 1068,00 ± 7726,41 × 103 sel /mL dalam sampel positif. Tidak ada sampel susu domba referensi, jadi tidak mungkin untuk menganalisis sampel susu referensi.

Sejak tahun 2017, ketika Damm dan rekan-rekannya memperkenalkan metode Foss DSCC untuk membedakan sel-sel somatik dalam susu sapi perah (Damm et al . 2017 ), kombinasi SCC dan DSCC untuk mendeteksi SCM menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi daripada SCC saja (Schwarz et al . 2020b ). Hubungan kedua indeks ini dengan produksi dan kualitas susu telah ditunjukkan dalam beberapa penelitian (Bobbo et al . 2020 ; Schwarz et al . 2020b ), dan penggunaannya telah menjadi topik hangat untuk mengidentifikasi SCM dan mengurangi kerugian terkait mastitis pada sapi (Huang et al . 2023 ). Meskipun sulit untuk menetapkan ambang batas yang sepenuhnya ditetapkan untuk DSCC di seluruh tingkat SCC, untuk tujuan praktis, batas 65% ditetapkan untuk mengkategorikan status kesehatan ambing sapi dalam kombinasi dengan ambang batas SCC 200 × 103 sel /mL (Schwarz et al . 2020b ).

Nilai batas untuk DSCC yang diamati dalam penelitian ini pada susu domba (71,2%) lebih tinggi daripada ambang batas yang ditetapkan dalam susu sapi (dari 65,0% hingga 69,3%) (Schwarz et al . 2020a , 2020b ). Penelitian sebelumnya mengamati persentase makrofag yang lebih rendah dalam susu domba dibandingkan dalam susu sapi (Albenzio et al . 2019 ). Karena nilai DSCC adalah persentase PMN dan limfosit pada SCC, hal ini dapat menjelaskan nilai batas DSCC yang lebih tinggi yang diamati dalam susu domba betina dalam penelitian ini. Meskipun belum ada penelitian yang dilaporkan sebelumnya tentang validasi metode FOSS DSCC untuk susu domba, baru-baru ini sebuah penelitian menetapkan nilai batas DSCC pada ras susu domba Valle del Berice (Tolone et al . 2023 ). Nilai batas DSCC ditentukan dengan menerapkan empat batas SCC yang sebelumnya dilaporkan dalam literatur (265, 500, 645, 1000 × 103 sel /mL) dan tidak ada pemeriksaan bakteriologis sampel susu yang dilakukan (Tolone et al . 2023 ). Namun, batas DSCC berkisar antara 76,1 hingga 79,8 untuk empat batas SCC yang dipilih (Tolone et al . 2023 ). Ini sesuai dengan batas DSCC yang dievaluasi dalam penelitian saat ini yang hasilnya lebih tinggi daripada batas DSCC sapi (Schwarz et al . 2020b ). Nilai AUC yang dilaporkan oleh Tolone dan rekannya cukup besar untuk setiap batas SCC yang digunakan (Tolone et al . 2023 ). Sebaliknya, nilai AUC yang dilaporkan dalam penelitian ini untuk batas DSCC berkisar dari gagal hingga cukup besar tergantung pada ras dan uji yang dianggap sebagai standar emas. Namun, penelitian yang dilakukan pada sapi menyarankan penggunaan kombinasi SCC dan DSCC untuk meningkatkan Se dan Sp dari uji ini untuk mengidentifikasi SCM (Bobbo et al . 2020 ; Schwarz et al . 2020a , 2020b ). Namun, dalam penelitian ini, sejauh pengetahuan kami, metode DSCC Foss divalidasi dalam susu domba untuk pertama kalinya, dan nilai batas SCC dan DSCC ditentukan untuk tiga ras susu perah domba betina yang penting di Italia. Penelitian lebih lanjut harus dilakukan pada domba untuk mempelajari kombinasi kedua nilai tersebut untuk membedakan tidak hanya ambing yang sehat dan yang terkena mastitis subklinis, tetapi, seperti pada sapi, juga, jika memungkinkan, kategorisasi ambing menjadi yang sehat, yang diduga mastitis, mastitis, mastitis kronis.

KESIMPULAN
Validasi metode Foss DSCC dan definisi nilai batas SCC dan DSCC dalam susu domba perah akan memungkinkan pengembangan studi lebih lanjut untuk meningkatkan skrining mastitis dan akan memberikan pemahaman yang lebih baik tentang patologi penting ini dalam produksi susu domba. Penggunaan nilai DSCC sebagai indikator SCM untuk susu domba akan memberikan definisi yang lebih tepat tentang status kesehatan ambing daripada nilai SCC saja. Penentuan DSCC dan SCC yang cepat, simultan, dan hemat biaya akan membantu petani, dokter hewan, dan teknisi untuk mengidentifikasi SCM dalam kawanan, yang memiliki dampak signifikan pada produksi dan kualitas susu.