ABSTRAK
Green Deal UE memprioritaskan transformasi industri kimia ke model yang lebih berkelanjutan secara lingkungan. Ini melibatkan penggunaan mikroorganisme, seperti Saccharomyces cerevisiae , untuk memproduksi molekul secara lebih berkelanjutan melalui pendekatan bioteknologi. Dalam studi ini, kami menunjukkan contoh produksi serotonin menggunakan S. cerevisiae sebagai pabrik sel, bersama dengan optimalisasi dan peningkatannya. Untuk mencapai ini, kami memperkenalkan dua gen heterolog, kombinasi triptofan dekarboksilase dari Clostridium sporogenes ( Cs TDC) dan triptamin 5-hidroksilase dari Oryza sativa ( Os T5H), untuk melengkapi jalur biosintesis serotonin menggunakan L-triptofan (L-TRP) sebagai prekursor. Dengan memodifikasi ARO4 ke versi yang tahan umpan balik ( ARO4 *), fluks jalur shikimat meningkat secara signifikan dan produksi serotonin dicapai pada kadar hingga 120 mg/L langsung dari sumber glukosa. Setelah pengoptimalan medium, konsentrasi akhir 80 g/L glukosa dan 300 mg/L nitrogen menghasilkan kondisi yang lebih baik untuk meningkatkan titer serotonin. Penggunaan medium ini dalam fermentasi bioreaktor 1 L menghasilkan sekitar 250 mg/L serotonin. Sebuah studi metabolomik terarah dari medium pertumbuhan bioreaktor mengidentifikasi potensi kemacetan pada galur yang memproduksi serotonin secara berlebihan dan target masa depan untuk meningkatkan titernya. Kami telah membangun galur S. cerevisiae yang merupakan langkah pertama menuju produksi serotonin industri yang layak menggunakan pendekatan yang berkelanjutan dan ramah lingkungan, yang membuka jalan bagi pengembangan strategi bioteknologi serupa di masa mendatang.

Abstrak Grafis
Strain ragi yang direkayasa untuk produksi serotonin. Media dan kondisi fermentasi telah dioptimalkan untuk mencapai produksi serotonin tertinggi dari semua strain S. cerevisiae hingga saat ini.

1 Pendahuluan
Serotonin adalah molekul turunan triptofan yang berperan penting sebagai neurotransmitter pada mamalia, yang sangat penting untuk fungsi normal sistem saraf dan sistem imun (Wu et al. 2019 ). Selain itu, keterlibatannya dalam sumbu mikrobiota-usus-otak baru-baru ini ditemukan sebagai faktor kunci dalam pensinyalan serotonergik, karena telah ditunjukkan bahwa mikrobiota usus juga terlibat dalam produksi serotonin (Jones et al. 2020 ; O’Mahony et al. 2015 ). Sebagai molekul turunan triptofan, ia memiliki struktur indol yang berfungsi sebagai perancah bagi molekul bioaktif lain dengan sifat-sifat menarik, seperti melatonin, untuk mengatur siklus tidur (Fatemeh et al. 2022 ), triptan untuk pengobatan migrain (Cameron et al. 2015 ) atau feruloil serotonin dan 4-coumaryloyl serotonin, yang berguna untuk digunakan dalam industri kosmetik (Kang et al. 2009 ; Roh et al. 2004 ). Selain itu, molekul serotonin itu sendiri memiliki aktivitas antioksidan (Sarikaya dan Gulcin 2013 ), yang menyoroti minatnya dalam produksi molekul ini dalam skala industri.

Serotonin saat ini diproduksi baik melalui sintesis kimia lengkap (Shaw 1955 ) atau dengan menggunakan molekul prekursor, 5-hydroxytryptophan, yang diekstrak dari biji Griffonia simplicifolia , dan melakukan modifikasi kimia. Proses ini sering kali melibatkan penggunaan pelarut organik, sehingga menghasilkan proses yang tidak ramah lingkungan. Karena alasan ini, produksi serotonin secara bioteknologi dapat menjadi alternatif yang berkelanjutan dengan potensi besar untuk produktivitas dan skalabilitas. Saccharomyces cerevisiae merupakan pilihan yang menarik sebagai pabrik sel untuk memproduksi molekul indol jenis ini karena terdapat pengetahuan yang luas tentang jalur biokimia yang terlibat, serta berbagai macam teknik molekuler yang diketahui untuk rekayasa metabolik dan penyuntingan genom (Borodina dan Nielsen 2014 ). Lebih jauh lagi, produksi alami ragi atas metabolit sekunder yang berasal dari triptofan membuatnya sangat menarik sebagai pabrik sel (Fernández-Cruz et al. 2017 ; Planells-Cárcel et al. 2024 ). S. cerevisiae adalah organisme GRAS (Generally Recognised As Safe), yang memfasilitasi penggunaannya dalam industri dalam hal keamanan. Beberapa penulis telah menggunakan S. cerevisiae sebagai sasis untuk produksi triptofan (L-TRP) atau molekul turunan lainnya (Albertin et al. 2017 ; Milne et al. 2020 ), yang menunjukkan potensi untuk produksi jenis molekul ini. Selain itu, penggunaan S. cerevisiae memfasilitasi pemurnian dan pemrosesan hilir dibandingkan dengan sasis mikroba lainnya (Borodina dan Nielsen 2014 ).

Jalur biosintesis serotonin dimulai dari L-TRP, tetapi tergantung pada organisme, jalur ini dapat berlangsung dengan dua cara yang berbeda. Pada mamalia, rute yang paling umum adalah pertama-tama hidroksilasi L-TRP menjadi 5-hidroksitriptofan (5-HTP), yang dilakukan oleh enzim triptofan hidroksilase (TPH), segera diikuti oleh dekarboksilasi 5-HTP menjadi serotonin, yang dilakukan oleh enzim triptofan dekarboksilase (TDC). Jalur ini membutuhkan kofaktor yang tidak ada dalam S. cerevisiae , karena enzim TPH membutuhkan tetrahidrobiopterin (BH4) bersama dengan oksigen untuk hidroksilasi. Sebaliknya, jalur yang paling umum pada tumbuhan adalah sebaliknya, dimulai dengan dekarboksilasi L-TRP menjadi triptamin oleh TDC, diikuti oleh hidroksilasi triptamin menjadi serotonin oleh triptamin 5-hidroksilase (T5H). Jalur kedua ini tidak memerlukan kofaktor BH4 karena enzim T5H termasuk dalam famili monooksigenase sitokrom P450, yang membutuhkan oksigen dan NADPH untuk menambahkan gugus hidroksil ke dalam molekul. Enzim sitokrom P450 bergantung pada sitokrom P450 reduktase (CPR), yang terlibat dalam transfer elektron antara NADPH dan enzim sitokrom P450 (Renault et al. 2014 ). Karena enzim CPR asli, yang dikodekan oleh gen NCP1 , sudah ada di S. cerevisiae , jalur ini dapat dilakukan di ragi (Lesuisse et al. 1997 ). Dalam penelitian sebelumnya, kami menganalisis rute produksi preferensial melatonin, molekul penerus serotonin, dalam ragi (Muñiz-Calvo et al. 2019 ). Dalam penelitian ini ditemukan bahwa jalur yang disukai S. cerevisiae untuk serotonin lebih mirip dengan jalur pada tumbuhan, karena tidak terdeteksi adanya aktivitas enzim L-TRP menjadi 5-HTP hidroksilase

Dalam penelitian ini, kami merekayasa strain yang mampu memproduksi serotonin secara berlebihan. Melalui karakterisasi media yang komprehensif, kami mengoptimalkan kondisi untuk meningkatkan produksi serotonin dari glukosa dan meningkatkan produksi dalam bioreaktor 1 L. Selain itu, kami mengidentifikasi beberapa target potensial untuk rekayasa metabolik lebih lanjut guna meningkatkan hasil serotonin.

2 Prosedur Eksperimen
2.1 Strain dan Media
Galur S. cerevisiae yang digunakan dan dikonstruksi dalam studi ini tercantum dalam Tabel S1 . Galur khamir dipelihara dalam medium YPD (20 g/L glukosa, 20 g/L pepton, 10 g/L ekstrak khamir) dan tumbuh pada suhu 28°C. Medium SD (1,7 g/L basa nitrogen khamir tanpa asam amino dan amonium sulfat Difco, 5 g/L amonium sulfat, 20 g/L glukosa) digunakan untuk uji produksi serotonin dari galur dengan plasmid episomal. SD yang disuplemen dengan L-TRP (2 g/L) digunakan untuk penyaringan transforman. Medium SD 80 (80 g/L glukosa, 1,7 g/L basa nitrogen khamir tanpa asam amino dan amonium sulfat) dengan 300 mg/L nitrogen digunakan untuk uji tabung reaksi. Dua kombinasi sumber nitrogen yang berbeda diuji dalam uji ini. Dalam salah satu pengujian ini, 300 mg/L nitrogen yang dapat diasimilasi disediakan oleh campuran ekuimolar amonium sulfat (0,75 g/L) dan L-TRP (2,19 g/L). Dalam pengujian lain, nitrogen yang dapat diasimilasi seluruhnya terdiri dari amonium sulfat (1,41 g/L). Dalam kasus pengujian bioreaktor, SD 80 digunakan dengan 300 mg/L nitrogen hanya dalam bentuk amonium sulfat. Bergantung pada kebutuhan auksotrofik setiap galur (Tabel S1 ), media dilengkapi dengan histidin (76 mg/L), urasil (76 mg/L) atau leusin (380 mg/L).

Untuk konstruksi plasmid, strain Escherichia coli NZYa (NzyTech) digunakan, dikultur dalam medium LB (10 g/L tripton, 5 g/L ekstrak ragi dan 5 g/L NaCl) dengan 100 mg/L ampisilin untuk mempertahankan plasmid dan tumbuh pada suhu 37°C.

2.2 Konstruksi Plasmid dan Strain
Semua plasmid dan primer yang dibuat yang digunakan dalam penelitian ini dapat ditemukan di Tabel S2 dan S3 . Urutan gen TDC dari Clostridium sporogenes ( Cs TDC) dan T5H dari Oryza sativa ( Os T5H) disintesis secara kimia oleh Twist Bioscience (California, AS) dan dioptimalkan untuk penggunaan kodon dari S. cerevisiae (Tabel S4 ).

2.2.1 Amplifikasi dan Kloning Gen
Gen sintetis Cs TDC dan Os T5H diperkuat menggunakan DNA polimerase Phusion High-Fidelity (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, AS) dan primer terkait yang dijelaskan dalam Tabel S3 . Kondisi PCR mencakup denaturasi awal pada 98°C selama 30 detik, diikuti oleh 30 siklus 98°C selama 10 detik, 60°C selama 30 detik, dan 72°C selama 30 detik per kb DNA target, dengan ekstensi akhir pada 72°C selama 10 menit. Produk yang diperkuat kemudian dicerna dengan enzim restriksi BamHI dan XhoI (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, AS) mengikuti rekomendasi pabrik pembuatnya. Produk yang dicerna dimurnikan menggunakan kit ekstraksi gel (NZYTech, Lisbon, Portugal) dan diligasikan ke dalam vektor p426GPD (Mumberg et al. 1995 ) menggunakan ligase DNA T4 (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, AS) pada suhu 16°C selama 1 jam.

2.2.2 Konstruksi Gen yang Tidak Peka terhadap Penghambatan Umpan Balik
Gen ARO4 K229 L ( ARO4 *) yang tidak peka terhadap inhibisi umpan balik diperoleh dari vektor ARO4* p423GPD yang telah dibangun sebelumnya (Bisquert et al. 2022 ). Untuk membangun TRP2 S65L S76L ​​( TRP2 *) yang tidak peka terhadap inhibisi umpan balik , ORF TRP2 pertama-tama diperkuat dari DNA genom strain ragi BY4743 menggunakan primer TRP2 BamHI F dan TRP2 XhoI R (Tabel S3 ). Kondisi PCR serupa dengan yang dijelaskan di atas. ORF TRP2 yang diperkuat kemudian dikloning ke dalam vektor p426GPD (Tabel S2 ) menggunakan situs restriksi BamHI dan XhoI. Untuk memperkenalkan mutasi S65R dan S76L, mutagenesis terarah-situs dilakukan menggunakan primer TRP2 S65R F/TRP2 S65R R dan TRP2 S76L ​​F/TRP2 S76L ​​R untuk memperkenalkan mutasi S65R dan S76L, masing-masing (Tabel S3 ). Dua proses mutagenesis berturut-turut dilakukan untuk mengubah setiap asam amino dalam urutan tersebut. Kondisi PCR mutagenesis mencakup denaturasi awal pada 98°C selama 30 detik, diikuti oleh 30 siklus 98°C selama 10 detik, 61°C selama 30 detik, dan 72°C selama 30 detik per kb DNA target, dengan ekstensi akhir pada 72°C selama 10 menit.

Setelah transformasi E. coli , PCR koloni dilakukan menggunakan primer GPD_test F dan CYC1_test R (Tabel S3 ) untuk menyaring koloni positif menggunakan NZYTaq II 2× Green Master Mix (NZYTech, Lisbon, Portugal). Koloni positif selanjutnya diverifikasi dengan sekuensing Sanger (genomik Eurofins, Ebersberg, Jerman).

2.2.3 Konstruksi Plasmid Integrasi Ganda
Beberapa plasmid integrasi dibangun menggunakan protokol dan vektor dari sistem EasyCloneMulti (Maury et al. 2016 ). Gen Sintetis Cs TDC dan Os T5H dikloning dalam plasmid integrasi multikopi pCfB2803. Untuk tujuan ini, kedua gen dan promotor dwiarah TEF1 p- PGK1 p diperkuat dengan PCR dari gen sintetis dan plasmid pCfB2628 (Germann et al. 2016 ) (Tabel S2 ) masing-masing, menggunakan polimerase Phusion U Hot Start (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, AS) dan primer spesifik untuk kloning USER CsTDC-GV1R, CsTDC-GP1F, OsT5H-GV2R, OsT5H-GP2F, PG1R(TEF1p) dan PG2R(PGK1p) (Tabel S3 ).

Gen ARO4 * yang tidak sensitif terhadap penghambatan umpan balik dikloning ke dalam plasmid pCfB2797 HIS3, turunan dari plasmid pCfB2797 (Maury et al. 2016 ), yang mengubah penanda seleksi dari URA3 menjadi HIS3 . Primer PV2F (GPDp) dan GV2R (ARO4) digunakan untuk tujuan ini. Kloning yang berhasil dikonfirmasi oleh PCR dengan primer ADH1_test F dan CYC1_test R (Tabel S3 ), diikuti oleh sekuensing Sanger (Eurofins Genomics, Ebersberg, Jerman).

2.2.4 Transformasi Ragi
Vektor integrator yang dihasilkan dilinearisasi oleh FastDigest NotI (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, AS) dan ditransformasikan ke dalam ragi menggunakan metode PEG/Lithium asetat (LiAc) (Daniel Gietz dan Woods 2002 ). Secara singkat, 150 μL kultur ragi yang tumbuh semalam diinokulasi ke dalam 5 mL media YPD segar dan diinkubasi pada suhu 28°C hingga total biomassa mencapai 2,5 × 108 sel . Sel kemudian dipeletkan, dicuci dengan LiAc (0,1 M), dipindahkan ke tabung 1,5 mL dan disentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 30 detik. Setelah membuang supernatan, sel disuspensikan kembali dengan 240 μL PEG 3350 (50% b/v), 36 μL LiAc (1,0 M), 50 μL DNA pembawa untai tunggal (2,0 mg/mL) dan 34 μL air steril ditambah 1 μg vektor integratif linier yang diinginkan untuk digabungkan oleh sel. Setelah inkubasi 30 menit pada suhu 42°C, sel dipeletkan, dicuci dengan air steril dan ditanam pada pelat media selektif. Untuk menghasilkan galur kontrol dan membuang auksotrofi yang tersisa dari galur rekayasa, setiap galur ditransformasi dengan produk liniernya masing-masing yang berasal dari plasmid integrasi ganda kosong yang sesuai (pCfB2803 untuk LEU2 , pCfB2797 HIS3 untuk HIS3 , dan pCfB2988 untuk URA3 ).

2.3 Budidaya
2.3.1 Kondisi Pertumbuhan untuk Penyaringan Transforman
Untuk memilih galur penghasil yang lebih tinggi, koloni murni dari semua galur dikulturkan terlebih dahulu semalam pada media YPD dan, setelah dicuci dengan air suling, diinokulasi pada OD 600 0,2 ke dalam pelat 24-sumur (BMG Labtech, Offenburg, Jerman) dengan 1,5 mL media SD yang dilengkapi dengan L-TRP. Untuk menguji variasi alel ARO4 * dan TRP2 * dalam plasmid episomal, media SD digunakan. Kultur ditumbuhkan selama 72 jam, dan OD 600 diukur. Kultur disentrifugasi selama 3 menit pada 10000×  g , dan supernatan disimpan pada suhu −20°C untuk kuantifikasi serotonin.

2.3.2 Kondisi Pertumbuhan untuk Optimasi Menengah
Untuk mikrofermentasi, digunakan Biolector II (m2p Labs, Aachen, Jerman). Prakultur strain BS4 disiapkan dalam tabung falcon 50 mL dengan medium YPD 10 mL dan diinkubasi pada suhu 28°C, 150 rpm, selama 24 jam. Kultur ditumbuhkan dalam FlowerPlates 48-well (MTP-48-B, m2p Labs, Aachen, Jerman) dengan volume total 1,5 mL. Sel dari prakultur dicuci dua kali dengan air suling dan diinokulasi ke dalam well yang sesuai untuk memperoleh konsentrasi sel awal 1 × 106 sel /mL (OD 600  = 0,1). Untuk pengujian optimasi medium, medium SD disesuaikan dengan berbagai konsentrasi nitrogen dan glukosa, yang disesuaikan dengan kondisi spesifik yang diuji. Untuk mengevaluasi efek dari jumlah nitrogen yang berbeda pada produksi serotonin, tiga media kultur disiapkan dengan konsentrasi amonium sulfat yang berbeda: 2,83 g/L untuk memperoleh 300 mg/L nitrogen, 1,32 g/L untuk memperoleh 140 mg/L nitrogen dan 0,52 g/L untuk memperoleh 55 mg/L nitrogen. Masing-masing kondisi ini mempertahankan 20 g/L glukosa sebagai sumber gula. Untuk evaluasi pengaruh konsentrasi gula pada produksi serotonin, dua kondisi dihasilkan: 20 g/L dan 80 g/L glukosa. Kedua kondisi tersebut mengandung 2,83 g/L amonium sulfat. Selain itu, 20,4 g/L kalium ftalat monobasa ≥ 99,5% (Sigma-Aldrich, Jerman) ditambahkan dan digunakan sebagai penyangga, dengan pH diatur ke 5. Triplikat biologis dilakukan dalam semua pengujian. Biomassa diukur sebagai unit cahaya yang tersebar (LSU) melalui filter biomassa (eksitasi 620 nm, emisi 620 nm, gain 1). Kelembaban dipertahankan pada > 85%, suhu diatur pada 28°C, dan kecepatan pengadukan diatur pada 1000 rpm dengan diameter pengocokan 3 mm, dengan data yang diambil selama 72 jam. Nilai laju pertumbuhan spesifik (μ maks ) dihitung berdasarkan data LSU untuk semua kondisi.

Untuk menentukan produksi serotonin setelah optimalisasi medium, galur BY4743, BS3 dan BS4 diinokulasi dalam 5 mL medium YPD dan tumbuh semalaman pada suhu 28°C dengan pengocokan orbital pada 300 rpm. Jumlah sel 2 × 106 sel /mL (OD 600  = 0,2) digunakan untuk diinokulasi dalam medium SD 80 dengan 300 mg/L nitrogen dalam dua kondisi nitrogen yang berbeda: satu dengan semua sumber nitrogen dari amonium sulfat, dan satu di mana terdapat rasio 1:1 antara amonium sulfat dan L-TRP. Galur diinokulasi ke dalam labu Erlenmeyer dengan rasio volume medium/volume total 1/5. Kultur ini diinkubasi di bawah agitasi konstan (150 rpm) pada suhu 28°C selama 72 jam. OD akhir 600 diukur, 1,5 mL kultur disentrifugasi selama 3 menit pada 10000×  g dan supernatan disimpan pada suhu −20°C untuk analisis HPLC-FLD.

2.3.3 Budidaya Bioreaktor
Fermentasi batch dengan galur BS4 dilakukan pada bioreaktor Biostat Qplus 1 L (Sartorius Stedim Biotech, Jerman) yang dilengkapi dengan probe pengukuran untuk pH, oksigen terlarut (DO), dan suhu. Media kultur yang digunakan adalah SD 80 dengan 300 mg/L nitrogen dalam bentuk amonium sulfat. Antifoam 204 (Sigma Aldrich, Jerman) pada 0,3 mL/L ditambahkan ke dalam media. Prakultur ditumbuhkan semalam dalam labu kocok 500 mL dengan 50 mL YPD yang diinkubasi pada suhu 28°C dan 150 rpm. Sel dicuci dua kali dengan air suling dan diinokulasi ke dalam bioreaktor pada kepadatan sel 2 × 106 sel /mL (OD 600  = 0,2) dalam volume akhir 1 L. Suhu bioreaktor dijaga konstan pada 28°C, pengadukan diatur pada 300 rpm dan pH dikontrol hingga 5 dengan penambahan basa (2 M NaOH) secara otomatis. Sebuah probe DO (Model OxyFerm-FDA 160, Hamilton) digunakan untuk mengukur konsentrasi DO, dan sebuah probe pH (Model EasyFerm Plus K8 160, Hamilton) digunakan untuk pH. Laju aliran volumetrik udara diatur pada 0,75 vvm (1 volume udara per volume media per menit). Selama fermentasi, gas buang CO 2 , O 2 dan etanol dipantau terus-menerus (Prima BT MS, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, AS), dan pengambilan data dilakukan menggunakan perangkat lunak Lucullus (Securecell AG, Urdorf, Swiss). Fermentasi dilakukan dalam rangkap tiga biologis.

2.4 Analisis Produksi Metabolit
2.4.1 Analisis Serotonin dengan HPLC-FLD
Serotonin dideteksi dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) pada kromatografi Waters ACQ Arc Sys Core (Waters, Milford, MA, AS), menggunakan kolom fase terbalik Accucore C18 (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, AS), dengan dimensi 4,6 × 150 mm dan ukuran partikel 2,6 μm. Sampel diencerkan hingga 50% dengan metanol absolut kualitas HPLC dan disaring dengan filter nilon 0,22 μm sebelum injeksi. Fase mobil yang digunakan adalah A (asetonitril) dan B (asam format 0,01% dalam air) dengan laju alir konstan 0,8 mL/menit; volume injeksi adalah 10 μL dan program gradien ditetapkan sebagai berikut: laju alir awal 5:95% (A:B) 0–7 menit, 90:10% (A:B) 7–11 menit, 5:95% (A:B) 11–17 menit. Deteksi analitik dilakukan pada detektor fluoresensi Waters 2475 (FLD) tempat kromatogram yang sesuai dengan λ eksitasi = 295 nm dan λ emisi = 330 nm diekstraksi. Waktu retensi serotonin dalam metode ini adalah 5,5 menit.

2.4.2 Analisis Indole Metabolik
Sampel dicairkan pada suhu kamar, diaduk selama 15 detik, dan disentrifugasi pada 10000 x g selama 15 menit pada suhu 4°C. Setelah itu, 50 μL dari setiap sampel dipindahkan ke tabung 1,5 mL dan dicampur dengan 50 μL larutan standar internal. Campuran tersebut diaduk selama 15 detik lagi dan kemudian dipindahkan ke pelat 96-sumur untuk analisis. Analisis beberapa senyawa indole (L-TRP, 5-HTP, tryptamine, serotonin, N-acetylserotonin, 5-metoxytriptamine, melatonin, N-formylkynurenine, L-kynurenine, asam kynurenic, asam xanthurenic, L-3-hydroxykynurenine, asam 3-hydroxyanthranilic, asam anthranilic, asam quinolinic, L-fenilalanin, L-tirosin) dilakukan dengan menggunakan UPLC-MSMS pada sistem Acquity-Xevo TQS (Waters, Milford, AS) dengan ionisasi elektrospray. Metode ini didasarkan pada metode yang telah divalidasi sebelumnya (Lario et al. 2017 ) menggunakan kondisi MRM yang dijelaskan di bawah ini: L-3-hydroxykynurenine 225,1 > 110; 5-HTP 221,1 > 162,2; 5-HTP (D4) 225 > 208; serotonin 177 > 115; serotonin (D4) 181 > 164; L-kynurenine 209 > 94; L-kynurenine (D4) 213 > 98; N-formylkynurenine 237,1 > 136; L-fenilalanin 166,1 > 91; asam 3-hidroksiantranilat 153,9 > 80; L-TRP (D5) 210 > 193; L-TRP 205 > 118; asam xanturenat (D4) 210 > 164; Asam xanturenat 206,1 > 132; asam kinurenat 190 > 89; asam kinurenat (D5) 195 > 149; triptamin (D4) 165 > 148; triptamin 161 > 122; asam antranilat 137,89 > 120; melatonin (D4) 237 > 178; melatonin 233,17 > 159; L-tirosin 182,1 > 91,0.

Analisis sampel dilakukan menggunakan kolom Acquity HSS T3 C18 (100 × 2,1 mm, 1,8 μm). Fase mobilnya adalah air (0,1% v/v asam format) (A) dan asetonitril (0,1% v/v asam format) (B). Gradien elusi seperti yang dijelaskan di bawah ini: fase B dipertahankan pada 2% dari 0 hingga 0,5 menit, kemudian meningkat secara linear hingga 45% selama 5 menit. Fase B kemudian ditingkatkan hingga 90% dalam 0,2 menit, segera diikuti oleh pengembalian cepat ke kondisi awal antara 5,7 dan 6 menit, yang dipertahankan selama 1,5 menit untuk penyeimbangan ulang kolom. Volume injeksi adalah 3 μL, laju alir 550 μL/menit, dan suhu kolom 55°C. Suhu autosampler ditetapkan pada 6°C selama analisis sampel. Ionisasi elektrospray dilakukan dengan menggunakan kondisi berikut: kapiler 2,9 kV, kerucut 25 V, suhu sumber 120°C, suhu desolvasi 395°C, laju aliran N2 kerucut 150 L/jam, dan gas desolvasi 800 L/jam.

2.5 Statistik
Uji t Student dilakukan untuk menentukan tingkat signifikansi pada perbandingan berpasangan antara galur yang dimodifikasi relatif terhadap galur kontrol. Tingkat signifikansi statistik ditetapkan pada nilai p p  ≤ 0,05. Analisis ANOVA Satu Arah digunakan, dikoreksi untuk beberapa perbandingan menggunakan uji Tukey ( keyakinan p  ≤ 0,05) untuk perbandingan antara galur kontrol, BS3 dan BS4 sehubungan dengan metabolit turunan triptofan. Signifikansi statistik ditunjukkan sebagai tanda bintang (* =  p  ≤ 0,05; ** =  p  ≤ 0,01; *** =  p  ≤ 0,001). Analisis dan gambar dibuat oleh GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, AS).

Analisis regresi dilakukan untuk menghitung nilai μmax dari mikrofermentasi dan fermentasi bioreaktor menggunakan Microsoft Excel 2016, dengan menggunakan koefisien determinasi ( R 2 ) di atas 95% sebagai signifikan secara statistik.

3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Menetapkan Strain Platform untuk Biosintesis Serotonin: Pemilihan Gen Heterolog
Dalam studi terkini dari kelompok kami (Muñiz-Calvo et al. 2019 ), kami mengusulkan bahwa serotonin dalam S. cerevisiae sebagian besar terbentuk melalui dekarboksilasi L-TRP yang diikuti oleh hidroksilasi triptamin, seperti pada tumbuhan. Atas dasar ini, kami memutuskan untuk menggunakan TDC dan T5H dalam urutan ini untuk mensimulasikan kondisi alami dalam ragi dan meningkatkan produksi (Gambar 1 ), dan untuk menghindari penambahan kofaktor dan rute daur ulang (Germann et al. 2016 ).

Setelah menentukan jalur yang akan disisipkan ke dalam sel, kami melakukan pencarian bibliografi untuk memilih enzim TDC dan T5H dengan aktivitas katalitik terbaik dan ekspresi yang baik pada ragi. Untuk enzim TDC, Williams dkk. ( 2014 ) menemukan aktivitas dekarboksilase khusus triptofan baru pada Clostridium sporogenes , yang mendekarboksilasi L-TRP untuk membentuk neurotransmitter β-arilamina triptamin.

Dalam kasus T5H, enzim ini tidak memerlukan kofaktor, seperti halnya dengan Homo sapiens triptofan hidroksilase (TPH) yang digunakan oleh Germann et al. ( 2016 ), yang memerlukan pengenalan jalur biosintesis dan regenerasi BH4 untuk menghindari kebutuhan untuk menambahkan kofaktor ini ke media pertumbuhan. Sebelumnya telah ditemukan bahwa enzim T5H dari beras ( Oryza sativa ) mampu menghidroksilasi triptamin menjadi serotonin. T5H sebelumnya dikloning dan diekspresikan secara berlebihan dalam E. coli , yang mampu menghasilkan serotonin dalam kombinasi dengan TDC, tetapi pada hasil yang lebih rendah sekitar 24 mg/L (Park et al. 2011 ), mungkin karena keluarga sitokrom P450 monooksigenase sulit dikloning dalam E. coli dan tidak selalu berfungsi secara langsung karena domain transmembrannya (Larson et al. 1991 ). Masalah ini tidak terjadi pada S. cerevisiae , yang dapat mengekspresikan komplemen lengkap sitokrom P450 dengan benar dan, oleh karena itu, dapat memiliki ekspresi protein Os T5H yang baik.

Untuk ekspresi optimal enzim yang dipilih, sintesis kimia dari kedua gen dipilih untuk mengubah urutan nukleotida dan mengoptimalkan penggunaan kodon untuk S. cerevisiae . Versi kodon yang dioptimalkan dari Cs TDC dan Os T5H digunakan untuk integrasi ke dalam genom ragi di bawah ekspresi promotor TEF1 p dan PGK1 p yang kuat, masing-masing. Selain itu, kami memilih integrasi gen daripada overekspresi plasmid episomal demi stabilitas dan pemeliharaan informasi terintegrasi melalui pembelahan sel (Maury et al. 2016 ). Oleh karena itu, gen yang diinginkan diintegrasikan dalam lokasi retrotransposon TY, keluarga elemen transposabel yang didistribusikan ke seluruh genom (Cameron et al. 1979). ), yang memungkinkan kami untuk menghasilkan beberapa penyisipan dari beberapa salinan kaset yang kami inginkan. Penelitian sebelumnya telah melaporkan penggunaan jenis plasmid ini untuk produksi hidroksitirosol atau psilocybin, yang menunjukkan manfaatnya untuk ekspresi gen berlebih dan produksi senyawa yang diinginkan (Bisquert et al. 2022 ; Milne et al. 2020 ). Oleh karena itu, kami memperkenalkan Cs TDC dan Os T5H melalui vektor integratif pCfB2803 yang menargetkan situs retrotransposon ragi Ty4.

Strain yang dihasilkan dinilai untuk produksi serotonin. Dua puluh empat koloni disaring setelah dikultur dalam media SD yang diperkaya dengan L-TRP (Gambar S1 ). Koloni yang menunjukkan produksi serotonin tertinggi (230 mg/L) dipilih dan ditetapkan sebagai strain BS1.

3.2 Merekayasa Jalur Shikimate untuk Meningkatkan Sintesis Serotonin dari Glukosa
Jalur shikimat adalah simpul utama dalam produksi asam amino dan metabolit terkait lainnya yang berfungsi sebagai molekul blok pembangun untuk berbagai macam metabolit sekunder yang berasal dari asam amino aromatik (Averesch dan Krömer 2018 ). Poin penting dalam membangun strain penghasil serotonin berlebih untuk penggunaan industri adalah untuk mencapai produksinya dari sumber yang sederhana dan ekonomis seperti glukosa. Selain itu, pasokan prekursor sangat penting dalam pabrik sel dan dapat secara signifikan memengaruhi produksi senyawa yang diinginkan. Oleh karena itu, untuk memfasilitasi biosintesis serotonin, strain tersebut dimodifikasi untuk menargetkan jalur shikimat, meningkatkan fluks metabolik ke L-TRP dari glukosa. Varian deregulasi protein ARO4 ( ARO4 K229L  −  ARO4 *; Fukuda et al. 1991 ), yang memicu peningkatan aliran jalur asam shikimat, dieksplorasi. Mutasi ini dilaporkan berhasil meningkatkan pool L-TRP dalam jumlah besar, sehingga peningkatan asam amino ini dapat digunakan oleh jalur heterolog (Bisquert et al. 2022 ; Milne et al. 2020 ; Zhang et al. 2020 ). Kami juga menemukan bahwa dalam literatur terdapat alel TRP2 yang bermutasi. yang bermutasi ( TRP2 S65R,S76L ) yang menciptakan bentuk enzim yang tahan umpan balik yang dapat membantu meningkatkan fluks ke L-TRP (Graf et al. 1993 ).

Uji coba pertama untuk membuktikan apakah varian alel ini dapat meningkatkan produksi serotonin secara langsung dari glukosa melibatkan pengekspresian berlebihan varian alel ini dalam plasmid episomal, menggunakan p426GPD TRP2 * dan p423GPD ARO4 *. Kedua plasmid ditransformasi secara individual dan dalam kombinasi di dalam galur BS1, menghasilkan galur BS1-T, BS1-A, BS1-TA, dan produksi serotoninnya dianalisis dengan membandingkannya dengan galur BS1 (Gambar S2 ). Peningkatan signifikan dalam produksi serotonin diamati pada galur BS1-A dibandingkan dengan galur BS1 dan BS1-T, yang juga menunjukkan peningkatan tetapi dengan hasil yang kurang signifikan. Galur BS1-TA, dengan kombinasi kedua varian alel yang bermutasi, tidak menunjukkan peningkatan signifikan dibandingkan dengan galur BS1-A; oleh karena itu, kami memutuskan untuk mengintegrasikan dalam beberapa salinan hanya varian ARO4* . Oleh karena itu, kami mengintegrasikan ARO4 * di bawah kendali promotor GPD dalam multi-salinan melalui vektor ekspresi pCfB27973 HIS3 yang menargetkan situs retrotransposon Ty2 ragi. Untuk memperoleh koloni dengan titer serotonin tinggi, prosedur yang sama seperti untuk pemilihan galur BS1 digunakan. Dua puluh empat koloni disaring secara acak untuk produksi serotonin dengan pengukuran HPLC-FLD setelah budidaya selama 72 jam dalam media SD yang diperkaya dengan L-TRP. Di antara mereka, klon yang menghasilkan sekitar 240 mg/L serotonin dipilih dan diberi nama BS2 (Gambar S3 ).

Meskipun semua modifikasi yang dilakukan pada BS2, galur tersebut tetap auksotrofik untuk urasil. Untuk menghilangkan kebutuhan suplementasi urasil dalam medium, galur BS2 ditransformasi dengan plasmid kosong pCfB2899, menciptakan galur BS4, yang melengkapi auksotrofi urasil dan memungkinkan pertumbuhan dalam medium minimal. Untuk tujuan membandingkan produksi antara galur dengan dan tanpa ARO4 *, prosedur yang sama diikuti pada galur BS1, mentransformasinya dengan pCfB2797 HIS3 dan pCfB2899 untuk melengkapi auksotrofi HIS3 dan URA3 masing-masing, menciptakan galur BS3. Penelitian telah menunjukkan bahwa perbedaan antara komplementasi genetik dan suplementasi nutrisi galur khamir auksotrofik, termasuk galur auksotrofik URA3 , dapat menunjukkan laju pertumbuhan dan profil metabolik yang berbeda, yang dapat memengaruhi hasil dan stabilitas produksi protein heterolog (Pronk 2002 ). Menariknya, baik pertumbuhan maupun produksi serotonin tidak terpengaruh oleh integrasi URA3 ke dalam BS2 dan HIS3 dan URA3 ke dalam BS1, karena tidak ada perbedaan signifikan dalam produksi serotonin yang terdeteksi (Gambar S4 ).

3.3 Optimasi Media untuk Produksi Serotonin
Komposisi kondisi fermentasi memainkan peran kunci dalam pertumbuhan ragi dan dapat secara langsung memengaruhi biosintesis produk akhir. Untuk mengeksplorasi kondisi fermentasi yang sesuai untuk galur BS4 hasil rekayasa kami, berbagai konsentrasi glukosa dan nitrogen dievaluasi (Gambar 2 ). Dasar pemikiran untuk memilih konsentrasi awal glukosa dan nitrogen ini berasal dari hasil penelitian kami sebelumnya tentang produksi berlebih hidroksitirosol, molekul bioaktif yang sangat menarik yang juga berasal dari metabolisme asam amino aromatik (Muñiz-Calvo et al. 2020 ; Bisquert et al. 2022 ).

Pertama, kami mempelajari efek konsentrasi nitrogen dalam kaitannya dengan produksi serotonin (Gambar 2A–C ). Untuk tujuan ini, kami melakukan beberapa kultur dengan jumlah total nitrogen yang berbeda dengan menggunakan mikrobioreaktor berthroughput tinggi yang memungkinkan evaluasi biomassa secara real-time dalam volume 1,5 mL. Sumber nitrogen yang digunakan adalah amonium, karena merupakan sumber yang murah dan sering digunakan dalam industri dan mudah diasimilasi oleh ragi. Secara khusus, kami mengevaluasi konsentrasi nitrogen tinggi (300 mg/L), sedang (140 mg/L) dan rendah (55 mg/L) dalam medium SD dengan 20 g/L glukosa.

Profil pertumbuhan berdasarkan hamburan cahaya (LSU) strain BS4 pada setiap kondisi dipantau (Gambar 2A ). Kami tidak mengamati perubahan signifikan apa pun dalam pertumbuhan sebelum 24 jam untuk nitrogen tinggi, menengah, dan rendah, menunjukkan semua kondisi μ maks sekitar 0,124 jam −1 (μ maks  = 0,1151 ± 0,027 jam −1 ; μ maks  = 0,1332 ± 0,026 jam −1 ; μ maks  = 0,1405 ± 0,026 jam −1 untuk nitrogen tinggi, menengah, dan rendah). Namun, setelah 24 jam BS4 menunjukkan perlambatan pertumbuhan. Galur yang tumbuh dalam kondisi nitrogen tinggi dan menengah adalah yang memiliki μ max lebih tinggi (masing-masing 0,0652 ± 0,013 h −1 dan 0,0746 ± 0,016 h −1 ), mencapai biomassa lebih tinggi. Sebaliknya, galur yang tumbuh dalam kondisi nitrogen rendah menunjukkan pertumbuhan lebih rendah (μ max  = 0,0471 ± 0,009 h −1 ) dan mencapai biomassa 25% lebih sedikit daripada dalam kondisi nitrogen tinggi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2B , produksi serotonin dipengaruhi oleh konsentrasi nitrogen. Titer serotonin tertinggi (47 mg/L) dicapai dalam kondisi kandungan nitrogen tinggi, yang menunjukkan korelasi positif antara ketersediaan nitrogen dan produksi serotonin. Kadar nitrogen menengah dan rendah menghasilkan titer serotonin yang lebih rendah (masing-masing 42 mg/L dan 34 mg/L). Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara kondisi nitrogen tinggi dan menengah, bahkan ketika titer serotonin dinormalisasi dengan biomassa (Gambar 2C ). Namun, penurunan yang signifikan pada titer serotonin dan rasio serotonin/biomassa diamati pada kondisi nitrogen rendah. Berdasarkan hasil ini, kami memutuskan untuk menetapkan 300 mg/L sebagai kondisi nitrogen optimal pada percobaan berikutnya.

Dalam penelitian kami sebelumnya, kami menunjukkan bahwa konsentrasi glukosa memengaruhi produksi metabolit sekunder yang berasal dari asam amino (Bisquert et al. 2022 ). Oleh karena itu, kami mengevaluasi efek glukosa dalam medium terhadap produksi serotonin (Gambar 2D–F ). Kami menguji 20 g/L dan 80 g/L glukosa dalam medium SD dengan 300 mg/L nitrogen dan memantau pertumbuhan strain BS4 selama 72 jam (Gambar 2D ). Awalnya, kedua galur menunjukkan profil pertumbuhan yang serupa (μ maks 0,09456 ± 0,0216 jam -1 dan 0,10041 ± 0,0252 jam -1 ), tetapi setelah 24 jam, galur BS4 yang tumbuh pada konsentrasi gula yang lebih tinggi menunjukkan laju yang lebih cepat (μ maks 0,0993 ± 0,0185 jam -1 ) dibandingkan dengan galur pada konsentrasi gula rendah (μ maks 0,0192 ± 0,0214 jam -1 ). Keduanya mencapai biomassa maksimumnya sekitar waktu fermentasi 72 jam. Seperti yang dapat diamati pada Gambar 2D , galur BS4 yang tumbuh dengan glukosa 80 g/L menunjukkan biomassa yang lebih tinggi, mencapai lebih dari dua kali lipat galur dalam kondisi glukosa 20 g/L. Pertumbuhan strain BS4 dalam 20 g/L glukosa menghasilkan 50 mg/L serotonin, sedangkan serotonin meningkat secara signifikan menjadi 120 mg/L dalam kondisi 80 g/L glukosa, disertai dengan peningkatan pertumbuhan sel (Gambar 2E) . ). Dengan demikian, peningkatan serotonin sebanding dengan peningkatan biomassa dengan rasio yang sedikit lebih tinggi tetapi tidak signifikan ketika kita membandingkan rasio serotonin/biomassa antara strain (Gambar 2F ). Meskipun demikian, hal ini menunjukkan bahwa kadar gula yang lebih tinggi meningkatkan produksi biomassa dan serotonin. Akibatnya, kondisi glukosa 80 g/L dipilih sebagai parameter untuk optimasi media kultur dalam percobaan berikutnya.

Singkatnya, kami mengevaluasi galur BS3 dan BS4 dalam kondisi optimal yang kami pilih, 80 g/L glukosa dan 300 mg/L nitrogen. Untuk tujuan ini, sumber nitrogen berasal dari bentuk amonium secara eksklusif, seperti yang telah dievaluasi sebelumnya pada uji optimalisasi medium, atau dari campuran amonium dan L-TRP dalam jumlah konsentrasi nitrogen yang sama, seperti yang digunakan pada seleksi koloni. Gambar 3 merangkum titer serotonin yang berbeda untuk tipe liar BY4743, BS3 (yang mengandung gen Cs TDC dan Os T5H untuk produksi serotonin) dan galur BS4 (latar belakang galur BS3 ditambah gen ARO4* ) setelah 72 jam pertumbuhan.

Seperti yang diilustrasikan dalam Gambar 3 , galur BS3 menunjukkan produksi serotonin tertinggi, sekitar 270 mg/L, ketika campuran amonium dan L-TRP digunakan sebagai sumber nitrogen. Produksi ini sekitar sembilan kali lebih tinggi daripada produksi yang dicapai hanya dengan menggunakan amonium (~29 mg/L). Suplementasi eksternal dengan L-TRP secara efektif dapat meningkatkan produksi senyawa turunan triptofan dengan menyediakan prekursor yang tersedia secara mudah, sehingga melewati beberapa keterbatasan regulasi dan metabolik dari jalur biosintesis endogen, seperti yang telah ditunjukkan untuk molekul turunan triptofan lainnya (Li et al. 2024 ; Reed et al. 2024 ). Tanpa diduga, titer serotonin berkurang secara signifikan hingga 214 mg/L pada galur BS4 dalam media sumber nitrogen campuran dengan L-TRP. Penurunan produksi serotonin ini ketika L-TRP hadir dalam strain yang mengekspresikan banyak salinan ARO4 * secara berlebihan dapat dijelaskan oleh beberapa jenis umpan balik retroinhibisi oleh L-TRP atau induksi enzim lain seperti ARO7 dan TRP2 (Schmidheini et al. 1990 ; Zalkin et al. 1984 ), yang mengarahkan fluks metabolik menuju jalur fenilalanin dan tirosin, mengurangi jumlah L-TRP dan akibatnya sedikit mengurangi kapasitas untuk memproduksi serotonin. Namun demikian, ketika hanya amonium yang digunakan, produksi serotonin oleh strain BS4 (139 mg/L) menunjukkan peningkatan 5 kali lipat dibandingkan dengan BS3, yang menunjukkan peran penting dari ekspresi berlebihan ARO4* dalam meningkatkan produksi serotonin tanpa adanya L-TRP dengan meningkatkan kumpulan chorismate dari glukosa.

Dari sudut pandang industri, penggunaan amonium sebagai sumber nitrogen secara umum lebih memungkinkan daripada penggunaan campuran amonium dan L-TRP. Garam amonium biasanya lebih murah dan lebih mudah diperoleh daripada L-TRP, sehingga lebih hemat biaya untuk produksi skala besar. Oleh karena itu, galur BS4 lebih menarik dari sudut pandang industri untuk menghasilkan serotonin rekombinan.

3.4 Optimasi Titer Serotonin yang Dihasilkan melalui Fermentasi Batch pada Bioreaktor 1 L
Untuk menunjukkan aplikasi industri strain BS4 sebagai pabrik sel serotonin, fermentasi batch dengan volume 1 L dilakukan. Fermentasi dilakukan dalam bioreaktor 1 L dalam rangkap tiga menggunakan media SD dengan 80 g/L glukosa dan 300 mg/L nitrogen dari sumber amonium. Dengan menggunakan sistem ini, kami dapat mengendalikan parameter utama seperti pH, agitasi atau pasokan oksigen dan menjamin kontrol yang lebih baik dari seluruh proses dibandingkan dengan fermentasi pelat mikrotiter atau labu goyang. Selama fermentasi 72 jam, persentase gas buang O 2 , CO 2 dan etanol yang diproduksi diukur secara real time melalui koneksi output ini ke spektrometer massa. Pengambilan sampel dilakukan pada 22, 25, 27, 29, 31, 26 dan 48 jam untuk menghitung biomassa berat kering (DW) dan serotonin yang diproduksi

Seperti yang diilustrasikan dalam Gambar 4 , pada 32 jam, CO2 mencapai puncaknya, diikuti oleh penurunan yang stabil setelah 48 jam. Titik ini menunjukkan akhir dari fase eksponensial, di mana biomassa menjadi stabil dan sel beralih ke fase stasioner. μmax yang dicapai adalah sekitar 0,1156 ± 0,0235 jam −1 . Jika kita memeriksa profil biomassa, kita dapat mengamati bahwa ia mencapai maksimumnya pada 36 jam, berbeda dengan 72 jam yang diperlukan dalam uji optimasi yang dilakukan dalam mikrofermenter. Hasil biomassa yang lebih tinggi ini dapat dijelaskan oleh volume yang lebih besar dan homogenisasi media yang lebih baik atau akses yang lebih baik ke oksigen dalam bioreaktor. Namun demikian, titer maksimum serotonin ekstraseluler adalah 250 mg/L, yang dicapai pada 36 jam, yang melebihi 140 mg/L yang diperoleh sebelumnya dalam uji shake flash, menjadi konsentrasi serotonin tertinggi yang diperoleh hanya dengan menggunakan amonium sebagai sumber nitrogen. Parameter fermentasi yang dihasilkan dari pengujian ini sesuai dengan hasil 3,125 mg/g glukosa dan produktivitas serotonin sebesar 6,94 mg/L/jam, menjadi awal yang menarik untuk membangun strain ragi sebagai platform industri untuk produksi serotonin.

3.5 Identifikasi Hambatan Metabolisme Menggunakan Teknik Metabolomik Terarah
Selama rekayasa metabolisme ragi untuk produksi metabolit heterolog, ketidakseimbangan fluks metabolisme sering muncul karena berbagai tingkat ekspresi beberapa gen dalam suatu jalur, yang menyebabkan akumulasi zat antara metabolik (Amer dan Baidoo 2021 ).

Untuk mengidentifikasi kemungkinan kemacetan metabolik yang disebabkan oleh modifikasi genetik berbeda yang dilakukan pada galur hasil rekayasa kami, kami melakukan studi metabolik tertarget awal pada senyawa berbeda yang terkait dengan serotonin dan L-TRP. Untuk tujuan ini, 20 senyawa metabolik dari sintesis serotonin dan turunannya, serta dari degradasi L-TRP melalui jalur kynurenine, dianalisis dalam galur BY4743, BS3 dan BS4 (Tabel S5 ). Untuk analisis ini, sampel titik akhir (72 jam; titik produksi serotonin maksimum) yang diperoleh dari uji produksi serotonin dalam labu kocok digunakan, dengan hanya memilih sampel dari media SD tanpa pengayaan L-TRP.

Gambar 5 menunjukkan bahwa serotonin adalah metabolit utama, dengan total 125 μM (22,00 mg/L) pada galur BS3 dan hingga 657 μM (115,63 mg/L) pada galur BS4. Peningkatan signifikan dalam produksi serotonin pada galur BS4, yang mengandung Cs TDC, Os T5H, dan ARO4* , dibandingkan dengan galur BS3, yang tidak memiliki ARO4 *, menyoroti dampak peningkatan pasokan prekursor pada sintesis serotonin. Secara khusus, galur BS4 menunjukkan serotonin 5,3 kali lebih banyak daripada galur BS3. Dalam kasus triptamin, galur BS3 menunjukkan sedikit peningkatan dibandingkan dengan galur kontrol. Namun, galur BS4 mengakumulasi 65 μM triptamin, yang 39 kali lebih tinggi daripada galur BS3. Akumulasi substansial ini menunjukkan bahwa sementara ekspresi berlebihan ARO4 * secara signifikan meningkatkan pasokan prekursor, laju konversi triptamin menjadi serotonin oleh Os T5H lebih rendah daripada konversi triptofan menjadi triptamin oleh Cs TDC. Ini menunjukkan bahwa aktivitas Os T5H mungkin merupakan faktor pembatas dalam galur pembuktian konsep kami. Tingkat ekspresi dan aktivitas enzim P450s yang rendah dalam ragi telah didokumentasikan dengan baik sebagai tantangan utama untuk aplikasi fundamental dan bioteknologi (Jiang et al. 2021 ). Untuk mengatasi masalah ini, berbagai strategi telah diusulkan, seperti ekspresi protein fusi P450 dan CPR atau P450-CPR, konstruksi galur ragi yang direkayasa untuk meningkatkan lingkungan mikro untuk P450, seperti yang baru-baru ini ditinjau oleh Jiang et al. ( 2021 ). Pada galur kami yang mengandung T5H, kami tidak mengekspresikan CPR heterolog apa pun secara berlebihan, tetapi mengandalkan aktivitas asli CPR endogen ragi yang dikodekan oleh NCP1 . Kompatibilitas antara P450 heterolog dan CPR asli pada ragi telah dilaporkan sebelumnya dalam produksi asam absisat (Otto et al. 2019 ). Dalam konteks ini, NCP1 kompatibel dengan enzim Botrytis cinerea P450; meskipun pengurangan 30% dalam OD 600 diamati untuk ekspresi berlebihan NCP1 dibandingkan dengan galur CPR B. cinerea (Otto et al. 2019 ). Untuk meningkatkan konversi triptamin menjadi serotonin oleh Os T5H, strategi masa depan mungkin mencakup optimalisasi kombinatorial pasangan P450–CPR, meningkatkan kumpulan heme atau NADPH, atau memicu perluasan retikulum endoplasma, yang merupakan strategi yang telah dieksplorasi untuk meningkatkan aktivitas P450 dalam ragi (Arendt et al. 2017 ; Cheng et al. 2024 ; Kim et al. 2019) .). Selain itu, akan sangat menarik bagi penelitian di masa depan untuk melakukan analisis keseimbangan fluks metabolik (FBA) guna memperoleh pemahaman yang lebih komprehensif tentang keterbatasan metabolik, mengukur hambatan yang teridentifikasi, dan mengembangkan strategi potensial lain yang ditargetkan untuk mengatasi keterbatasan ini dan meningkatkan efisiensi dan produktivitas serotonin.

Mengenai produk hilir dari serotonin, seperti N-asetil serotonin, 5-metoksi triptamin dan melatonin, kami mengamati peningkatan terbesar N-asetil serotonin di BS4, naik ke konsentrasi 25 μM. Dalam publikasi kami sebelumnya, kami telah melaporkan bahwa setidaknya HPA2 , bersama dengan PAA1 dalam ragi, terlibat dalam asetilasi triptamin, serotonin dan 5-metoksi triptamin (Bisquert et al. 2023 ). Aktivitas N-asetiltransferase ini dapat berperan dalam peningkatan N-asetil serotonin yang diamati ketika kadar serotonin yang tinggi disebabkan oleh ekspresi berlebihan Cs TDC dan Os T5H. Mengenai 5-metoksi triptamin dan melatonin, sedikit peningkatan diamati pada galur BS4 dibandingkan dengan BS3, tetapi konsentrasinya mencapai sekitar 2 nM, jauh lebih rendah daripada metabolit lain dalam urutan μM. Hingga saat ini, belum ada indole O-methyltransferase yang telah dideskripsikan dalam S. cerevisiae , yang merupakan enzim terakhir dalam sintesis melatonin vertebrata. Oleh karena itu, masih harus dilihat apakah enzim yang terlibat dalam sintesis melatonin dalam ragi hanya terlibat dalam proses ini atau, seperti yang telah disebutkan oleh Ganguly et al. ( 2001) ), sintesis molekul ini mungkin mencerminkan tindakan oportunistik dari enzim metabolik yang tidak terkait dengan fungsi yang luas.

Perlu dicatat juga bahwa peningkatan fluks metabolisme dalam jalur asam shikimat tidak memengaruhi asam amino aromatik lainnya, seperti L-tirosin atau L-fenilalanin, meskipun keduanya menunjukkan sedikit penurunan (Gambar 5 ). Hal ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa keberadaan gen TDC dan T5H memaksa fluks metabolisme menuju serotonin dan memungkinkan asam amino lainnya menjaga konsentrasinya tetap seimbang.

Dalam kasus metabolit dari katabolisme L-TRP, terdapat beberapa akumulasi asam, dengan asam kynurenic meningkat hingga 8,12 μM, asam xanthurenic hingga 13,78 μM dan asam 3-hydroxyanthranilate hingga 26,42 μM. Salah satu efek paling mencolok dari integrasi multi-salinan ARO4* adalah akumulasi asam antranilat, mencapai 268,83 μM. Ini dapat berasal dari peningkatan fluks metabolik ke jalur asam shikimat, yang merupakan produk dari enzim anthranilate synthase ( TRP2 ), tetapi juga dapat berasal dari degradasi L-kynurenine untuk menghasilkan alanin. Antranilat adalah molekul prekursor untuk L-TRP, sehingga peningkatan ekspresi gen hilir molekul ini akan membuka hambatan ini dan meningkatkan aliran menuju L-TRP, dan akibatnya menuju produksi serotonin yang lebih tinggi. Beberapa gen yang menarik untuk diuji untuk ekspresi berlebih adalah TRP4 , TRP1 , TRP3, dan TRP5 .

4 Kesimpulan dan Prospek Masa Depan
Meningkatnya permintaan masyarakat akan gaya hidup yang lebih sehat dan harapan hidup yang lebih panjang menantang industri makanan dan farmasi untuk menemukan sumber obat dan bahan makanan yang meningkatkan kesehatan, alami, dan efektif. Beberapa molekul yang berasal dari metabolisme asam amino aromatik ragi baru-baru ini menarik banyak perhatian karena manfaat kesehatannya. Serotonin adalah molekul turunan L-TRP yang memainkan peran penting pada mamalia sebagai neurotransmitter yang memainkan peran regulasi penting dalam banyak fungsi kognitif dan perilaku, serta dalam komunikasi dan regulasi mikrobiota usus. Serotonin dapat diperoleh melalui sintesis kimia atau ekstraksi dari hewan atau tumbuhan; namun, tantangan saat ini, seperti masalah lingkungan dan penggunaan bahan yang tidak berkelanjutan, telah membatasi hasil serotonin hingga jauh di bawah keluaran maksimum teoritis (Shen et al. 2022 ). Oleh karena itu, metode bioteknologi sederhana untuk produksi senyawa ini diinginkan. Beberapa penelitian sebelumnya telah mengembangkan platform E. coli rekayasa metabolik untuk produksi serotonin tingkat tinggi dari L-TRP (Li et al. 2024 ; Shen et al. 2022 ; Wang et al. 2022 ), terutama melalui ekspresi berlebih heterolog dari enzim vertebrata, yang memiliki kelemahan dalam penggunaan kofaktor yang tidak tersedia dalam bakteri. Dalam penelitian kami, kami mengikuti strategi yang sangat baru dengan menggunakan gen bakteri yang belum digunakan untuk sintesis serotonin dan gen tanaman yang membutuhkan NADPH untuk melakukan transformasi enzimatik. Hasil kami menunjukkan tingkat konversi L-TRP yang tinggi menjadi triptamin oleh dekarboksilase C. sporogenes dengan mengintegrasikan dan mengekspresikan berlebih gen bakteri ini ke dalam genom S. cerevisiae . Kami juga menunjukkan laju hidroksilasi triptamin yang efisien menjadi serotonin oleh T5H dari O. sativa dan, yang kami anggap sangat penting dalam hal mengurangi beban metabolik strain yang dibangun, reaksi ini dilepaskan dari kofaktor vital endogen tetrahidrobiopterin (BH4) untuk produksi serotonin yang efisien. Seperti yang diharapkan, ekspresi berlebih dari versi ARO4* yang tahan umpan balik secara signifikan meningkatkan fluks jalur shikimat dan titer serotonin menggunakan kerangka karbon yang berasal langsung dari glukosa, dari urutan 0,352 mg/L dari strain kontrol menjadi 139 mg/L, yang mewakili peningkatan sekitar 400 kali lipat. Optimalisasi media pertumbuhan dan kondisi fermentasi menghasilkan konsentrasi serotonin tertinggi yang dilaporkan sejauh ini untuk strain ragi (250 mg/L), meskipun konsentrasi ini dapat ditingkatkan dengan beberapa perbaikan spesifik pada strain saat ini, sebagaimana dibuktikan oleh analisis metabolomik.

Telah diketahui secara umum bahwa S. cerevisiae adalah salah satu kerangka pilihan bagi industri bioteknologi sebagai pabrik sel untuk produksi molekul rekombinan, berkat sejumlah keuntungan seperti pertumbuhan yang kuat pada media sederhana, kelayakan manipulasi genetik dan “umumnya dianggap aman” (GRAS) (Guo et al. 2019 ; Nielsen et al. 2013 ). Kami telah membangun strain S. cerevisiae yang mewakili langkah pertama menuju produksi industri serotonin yang layak melalui pendekatan yang berkelanjutan dan ramah lingkungan, membuka jalan bagi pengembangan strategi bioteknologi serupa di masa depan. Studi masa depan menggunakan analisis keseimbangan fluks metabolik (FBA), peningkatan enzim melalui rekayasa protein, dan pendekatan lain untuk meningkatkan ekspresi fungsional P450 dalam ragi dapat secara signifikan meningkatkan produksi bioteknologi serotonin.