ABSTRAK
Analog melamin ilegal ditambahkan ke makanan agar tampak mengandung lebih banyak protein. Zat-zat ini memiliki dampak negatif pada manusia dan hewan dalam jumlah besar. Makalah ini meneliti bagaimana racun kobra melindungi tikus dari hepatotoksisitas yang disebabkan melamin. Studi saat ini dilakukan pada enam kelompok tikus jantan dewasa, sebagai berikut: kelompok I (kontrol negatif): IP disuntik dengan air suling, kelompok II (SV10 μg/kg): IP disuntik dengan 10 μg/kg racun kobra, kelompok III (SV20 μg/kg): IP disuntik dengan 20 μg/kg racun kobra, kelompok IV (melamin): oral 700 mg/kg melamin, kelompok V (melamin + SV10 μg/kg): diobati dengan 10 μg/kg racun kobra, kelompok VI (melamin + SV20 μg/kg): diobati dengan 20 μg/kg racun kobra. Pengobatan dengan bisa ular memperbaiki fungsi hati dan meningkatkan penanda tingkat apoptosis Caspase-3, menurunkan penanda tingkat antiapoptotik BAX. Selain itu, menurunkan penanda tingkat inflamasi IL-2 dan tingkat ekspresi IL-10, INF-γ. Pengobatan dengan bisa ular memperbaiki hepatotoksisitas yang disebabkan oleh melamin pada tikus albino.

1 Pendahuluan
Salah satu organ utama yang bertanggung jawab atas proses metabolisme dan ekskresi tubuh adalah hati. Hati memainkan peran penting dalam membuang xenobiotik dan bahan berbahaya. Penyakit hati dianggap sebagai penyebab utama kematian dan morbiditas di seluruh dunia, terutama akibat ketidakmampuan hati untuk membuang zat berbahaya dengan benar (AlSaadi et al. 2018) ).

Melamin (MA) adalah bahan organik yang diproduksi dengan mensintesis urea, bahan kimia berbasis nitrogen. 66% nitrogen ditemukan dalam urea (Liao et al. 2021 ), yang diproduksi ketika asam sianat disintesis dari melamin. Melamin dan formaldehida digabungkan dalam industri untuk membuat resin melamin, yang digunakan dalam penghambat api, papan hapus kering, tekstil, bahan perekat, dan plastik termoseting tahan lama (EPoCitF Chain, E 2010 ). Studi menemukan bahwa memakan makanan yang tercemar melamin adalah penyebab utama kematian banyak hewan peliharaan yang tidak disengaja (Dorne et al. 2013 ). Selain itu, ditemukan bahwa limfosit limpa mengalami efek sitotoksik dari MA yang diberikan setiap hari dengan dosis 50 mg/kg (Wang et al. 2009 ).

Genus Naja (kobra) mencakup kobra Nubia ( Naja nubiae ), sejenis kobra penyembur yang berasal dari Afrika (Theakston et al. 2003 ). Pola racun kobra penyembur Mesir dicirikan oleh sitotoksisitas (Warrell et al. 1976 ). Selain itu, kobra penyembur Nubia memiliki sifat antiinflamasi, analgesik, dan antipiretik yang membuatnya menguntungkan untuk digunakan (Abdel-Daim et al. 2015 ).

Bisa ular kobra adalah campuran kompleks yang utamanya terdiri dari protein dan peptida yang memberikan berbagai efek toksik, termasuk neurotoksisitas, kerusakan jaringan, dan komplikasi sistemik. Terapi antibisa tetap menjadi pengobatan utama untuk envenomasi, yang berhasil mengurangi efek kritis seperti pendarahan dan kelumpuhan. Namun, penelitian terbaru telah mengungkapkan bahwa molekul turunan bisa tertentu memiliki potensi terapeutik, yang membuka kemungkinan baru untuk pengembangan obat (Lafnoune et al. 2024 ). Ada minat yang meningkat pada berbagai komponen bisa sebagai kemungkinan sumber zat farmasi baru yang dapat berguna untuk mengobati penyakit manusia. Telah ditemukan bahwa fosfolipase A2 dari bisa lebah memberikan pertahanan terbaik terhadap hepatotoksisitas yang diinduksi asetaminofen (Kim et al. 2014 ). Di sisi lain, diketahui bahwa sebagian besar bisa ular mengandung dua jenis zat yang berfungsi berlawanan satu sama lain dengan mengaktifkan atau menghambat faktor koagulasi (Fatima dan Fatah 2014 ). Dengan demikian, tujuan penelitian saat ini adalah untuk menentukan apakah bisa ular kobra dapat melindungi tikus dari hepatotoksisitas akibat melamin.

2 Bahan dan Metode
2.1 Bahan Kimia
Melamin: Dibeli dalam bentuk murni dari Sebra Chemical Co., AL Asher, kota Ramadan.

Bisa ular kobra: Dibeli dari Departemen Zoologi, Fakultas Sains, Universitas Terusan Suez setelah dikumpulkan oleh para peneliti di Departemen Zoologi, Fakultas Sains, Universitas Terusan Suez.

Pengumpulan bisa ular kobra: Sepuluh spesimen ular Naja nubiae (campuran jantan dan betina) dikumpulkan pada bulan Maret 2022 dari daerah Nubia di Aswan, Mesir, untuk pengumpulan bisa ular kobra. “Teknik Mirtschin” adalah metode yang digunakan untuk mengumpulkan bisa mentah selama proses pemerahan ular kobra (Tibballs 2001 ). Botol 70 mL dengan membran para-film yang dibungkus di atasnya didorong ke ular untuk menggigitnya. Di bawah membran, di dalam botol, bisa dikumpulkan. Setelah dicampur dalam rasio 1:10 dengan air suling steril, racun tersebut dikeringkan dalam keadaan beku (liofilisasi LABCONCO, sistem pembekuan cangkang, AS) dan disimpan pada suhu −20°C.

2.2 Manajemen Hewan
Tikus albino jantan dewasa dengan berat 180–200 g diperoleh dari Pusat Perawatan Hewan Eksperimental di Universitas Zagazig dan ditempatkan di kandang di rumah hewan eksperimen fakultas sains selama 7 hari sebelum percobaan. Lingkungan dikontrol pada suhu 25°C dengan siklus terang/gelap 12 jam.

Pedoman untuk perawatan dan penggunaan subjek hewan termasuk dalam Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium, serta protokol yang disetujui oleh Komite Etik (ZU-IACUC/2/F/38/2022).

Model hepatotoksisitas: Selama 28 hari, satu dosis 700 mg/kg berat badan bubuk melamin terlarut dalam air suling hangat diberikan secara oral setiap hari (Early et al. 2013 ).

2.3 Studi Toksisitas
Menggunakan 10 hewan tikus albino, metode perkiraan digunakan untuk menentukan dosis mematikan median (LD50 ) bisa ular kobra (Meier dan Theakston 1986 ).

2.4 Desain Eksperimen
Untuk mencapai tujuan akhir penelitian, 48 tikus albino jantan dewasa dibagi menjadi enam kelompok, masing-masing terdiri dari delapan hewan, setelah mereka diaklimatisasi selama 7 hari dengan diet basal yang khas.

Kelompok I (kelompok kontrol negatif): Tikus IP disuntik dengan 2 mL air suling setiap hari. Kelompok II (Sv10 μg/kg): Tikus IP disuntik dengan 2 mL racun kobra 10 μg/kg sekali sehari selama 6 hari. Kelompok III (Sv20 μg/kg): Tikus IP disuntik dengan 2 mL racun kobra 20 μg/kg sekali sehari selama 6 hari. Kelompok IV (melamin): Tikus menerima (700 mg/kg B.wt.) secara oral hari demi hari selama 28 hari. Kelompok V (melamin + SV10 μg/kg): tikus diinduksi oleh melamin hari demi hari selama 28 hari kemudian disuntik secara intraperitoneal dengan 2 mL SV10 μg/kg selama 6 hari. Kelompok VI (melamin + SV20 μg/kg): tikus diinduksi dengan melamin hari demi hari selama 28 hari kemudian disuntik secara intraperitoneal dengan 2 mL SV20 μg/kg selama 6 hari.

2.5 Pengumpulan dan Pengambilan Sampel Darah
Tikus diberi puasa selama 12 jam pada akhir penelitian, dan setelah perawatan terakhir, sampel darah diambil dari pleksus vena retroorbital mereka saat mereka berada di bawah anestesi eter ringan (Waynforth 1980 ). Dua tabung digunakan untuk mengumpulkan sampel darah: satu untuk analisis CBC (termasuk EDTA) dan satu lagi untuk serum. Setelah sentrifugasi selama 20 menit pada 4000 g , serum dipindahkan ke tabung Eppendorf dan disimpan beku pada suhu -20°C hingga uji biokimia dilakukan.

2.6 Sampel Jaringan
Bagian pertama dari sampel jaringan hati dihomogenkan dengan larutan penyangga fosfat dingin (pH 7,4) untuk menyiapkan homogenat jaringan 10% (b/v). Bagian kedua dari sampel jaringan hati digunakan untuk studi gen. Bagian ketiga menjalani analisis histopatologi.

2.7 Hitung Darah Lengkap (CBC)
Menghitung jumlah trombosit (PLT), sel darah putih (WBC), sel darah merah (RBC), dan hemoglobin (Hb%), (MCHC), (MCV), (PDW), dan (MCH) menggunakan sampel darah yang diheparinisasi yang dikumpulkan dalam tabung EDTA. Selain itu, hitungan diferensial dilakukan menggunakan penghitung darah hewan vet ABC untuk sel polimorf dan limfosit.

2.8 Tes Fungsi Hati
Kit kolorimetri pengujian digunakan untuk mengukur aktivitas serum ALT (alanine aminotransferase) dan AST (Aspartate aminotransferase) (Reitman dan Frankel 1957 ). Uji Bromcresol Green Binding (BCG) yang dimodifikasi untuk penentuan konsentrasi serum albumin (Doumas 1971 ). Estimasi kolorimetri dari total kandungan protein didasarkan pada gagasan bahwa dalam keadaan basa, tembaga yang dimodifikasi bergabung dengan ikatan peptida protein untuk menghasilkan kompleks biuret merah muda hingga ungu yang khas (Doumas et al. 1981 ). Konsentrasi bilirubin total dan langsung serum dinilai menggunakan pengukuran fotometrik setelah bilirubin diubah menjadi asam sulfanilat diazotisasi berwarna (Jendrassik dan Grof 1938 ).

2.9 Penentuan Konsentrasi IL-2, BaX, dan Caspase-3 Tikus dalam Homogenat Jaringan Hati
Tingkat IL-2, BaX, dan caspase-3 dalam homogenat jaringan hati ditentukan dengan teknik ELISA menggunakan kit yang dibeli dari MBS biosciences Inc. (Nomor Katalog: MBS175774) (Hollander et al. 1998 ), LSBIO life span bio sciences Inc. (Nomor Katalog: LS-F21494). MBS bio sciences Inc. (Nomor Katalog: MBS7244630).

2.10 Penentuan Tingkat Ekspresi IL-10 dan INF-γ pada Jaringan Hati
Setelah sampel darah diambil, jaringan diawetkan dan dibekukan pada suhu -80°C. PCR real-time dilakukan.

2.10.1 Ekstraksi RNA
RNA diekstraksi dari sampel jaringan menggunakan QI Aamp R Neasy Mini kit (Qiagen, Jerman, GmbH) (Bare et al. 2018 ).

2.10.2 Primer Oligonukleotida
Primer yang digunakan tercantum dalam tabel (C) dan disediakan oleh Metabion (Jerman). SYBR green One-Step qRT-PCR Super Mix (Trans Script Green). Satu mikroliter (μL) setiap primer (maju dan mundur) pada konsentrasi 20 pmol, 0,5 μL pewarna referensi, 4 μL air, 5 μL cetakan RNA, dan 1 μL 2× perfect StartTM Green One-step qPCR Master Mix terdiri dari reaksi 25 mL. Reaksi dilakukan menggunakan peralatan PCR real-time One-Step. Profil termalnya adalah sebagai berikut, sesuai petunjuk kit: 40 siklus amplifikasi (94°C selama 5 detik, 58°C selama 15 detik, dan 72°C selama 10 detik) dilakukan setelah langkah transkripsi terbalik pada suhu 45°C selama 5 menit dan denaturasi primer pada suhu 94°C selama 30 detik (Batusic et al. 2011 ).

2.10.3 Analisis Hasil RT-PCR SYBR Green
Kurva amplifikasi dan nilai Ct ditentukan oleh perangkat lunak langkah pertama. Untuk memperkirakan variasi ekspresi gen dalam RNA dari sampel yang berbeda, CT dari setiap sampel dibandingkan dengan kelompok kontrol positif menurut metode “ΔΔCt” yang dinyatakan dengan menggunakan rasio berikut: (2 −ΔΔct ) (Bancroft dan Stevens 2016 ).

2.11 Pemeriksaan Histopatologi
Menurut proses untuk persiapan histologis yang terlibat adalah mengiris jaringan hati hingga ketebalan 3–4 mm, memfiksasinya dalam 10% formalin penyangga netral (10% NBF), mendehidrasinya dalam berbagai konsentrasi etanol, membersihkannya dalam xilena, dan menanamkannya dalam parafin. Untuk mempelajari struktur jaringan umum, blok parafin dipotong menggunakan mikrotom pada ketebalan 4–6 μm dan kemudian diwarnai dengan hematoksilin dan eosin. Mikroskop Leica (CH9435 Hee56rbrugg) digunakan untuk memeriksa potongan yang diwarnai H&E (Leica Microsystems, Swiss) (Bancroft dan Stevens 2016 ).

2.12 Analisis Statistik
Rata-rata ± SEM digunakan untuk mengekspresikan setiap parameter. ANOVA satu arah digunakan untuk menilai data secara statistik, dan uji perbandingan berganda Duncan digunakan setelahnya. Nilai p sebesar 0,05 diperlukan untuk hasil yang signifikan. Paket perangkat lunak SPSS 20 (Analytical Software, AS) digunakan untuk melengkapi analisis. Dengan memanfaatkan GraphPad Prism 8 (GraphPad, CA, AS), diagram dibuat.

3 Hasil
3.1 Studi Toksisitas
Ditemukan bahwa LD 50 bisa ular sama dengan 0,2 mg/kg berat tubuh.

3.2 Efek Pengobatan Bisa Ular terhadap Studi Hematologi
Temuan yang disajikan dalam Tabel 1 menunjukkan penurunan signifikan pada rata-rata kadar HB, jumlah sel darah merah, nilai MCH (Mean corpuscular hemoglobin), MCV (Mean corpuscular volume), dan MCHC (Mean corpuscular hemoglobin concentration) dan peningkatan signifikan pada jumlah PLT dan WBC pada kelompok melamin dibandingkan dengan kelompok kontrol. Pada kelompok yang diberi perlakuan (melamin + SV10 μg/kg) dan (melamin + SV20 μg/kg) dilaporkan peningkatan yang baik pada semua parameter dibandingkan dengan kelompok kontrol.

3.3 Efek Pengobatan Bisa Ular terhadap Tes Fungsi Hati
Tabel 2 menunjukkan peningkatan yang signifikan pada rerata aktivitas ALT, AST ( p  < 0,001), kadar T. Bil ( p  < 0,01), dan penurunan konsentrasi ALB ( p  < 0,01) & protein T. ( p  > 0,05) pada kelompok melamin dibandingkan dengan kelompok kontrol. Pada kelompok yang diberi bisa ular menunjukkan perbaikan yang baik dibandingkan dengan kelompok kontrol.

3.4 Pengaruh Pemberian Bisa Ular terhadap Kadar IL-2, BAX, dan Caspase-3 pada Jaringan Hati Kelompok Subyek yang Diteliti
Temuan yang disajikan dalam Tabel 3 ; Gambar 1 menunjukkan peningkatan yang signifikan pada kadar rata-rata IL-2 & BAX dalam kelompok melamin, masing-masing sebesar 249,6% & 191,5% ( p  < 0,01) jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Selain itu, kadar rata-rata Caspase-3 dalam kelompok melamin turun secara signifikan sebesar -64% ( p  < 0,01) jika dibandingkan dengan kelompok kontrol.

3.5 Pengaruh Pemberian Bisa Ular terhadap Tingkat Ekspresi Gen IL-10 dan INF-γ pada Jaringan Hati Kelompok yang Diteliti
Temuan yang disajikan pada Tabel 4 ; Gambar 2 menunjukkan peningkatan tinggi rata-rata tingkat ekspresi IL-2 dan INF-γ pada kelompok melamin, masing-masing sebesar 457% dan 552% ( p  < 0,001) jika dibandingkan dengan kelompok kontrol.

3.6 Pemeriksaan Histopatologi
Kelompok I: (Kontrol Negatif), Kelompok II: (SV10 μg/kg), dan Kelompok III: (SV20 μg/kg) yang menunjukkan arsitektur normal triad portal dengan vena porta, arteri hepatik, dan duktus biliaris utuh (persegi panjang). Tali pusat hepatik tersusun dalam tampilan teratur yang mengandung hepatosit besar dengan nukleus sentral, bulat, dan vesikular (panah). Perhatikan sinusoid hepatik yang menampakkan diri di antara tali pusat hepatik (kepala panah). Kelompok IV: (Kelompok Melamin) yang menyoroti perubahan degeneratif serius termasuk dilatasi parah, kongesti (bintang) dan hialinisasi (persegi panjang) vena porta, peningkatan jumlah serat yang jelas (panah dengan ekor), agregasi berlebihan sel inflamasi (panah gelombang), hilangnya organisasi hepatik (lingkaran), degenerasi hidropik hepatosit (panah), dan atrofi sepanjang sinusoid hepatik (kepala panah). Kelompok V: (Melamin + SV10 μg/kg) menyingkapkan perubahan signifikan dalam arsitektur jaringan seperti yang terlihat dari pita hati biasa dengan hepatosit yang hampir normal (panah), dan beberapa kongesti sepanjang vena porta (persegi panjang) kecuali beberapa yang ditandai dengan degenerasi hepatosit ringan (panah melengkung), beberapa agregasi sel inflamasi (panah gelombang), sebagai tambahan pada sebagian besar sinusoid darah yang ditandai dengan tampilan utuh sementara beberapa terlihat dengan kongesti (kepala panah). Kelompok VI (Melamin + SV20 μg/kg) menampilkan sedikit pemulihan yang dibuktikan dengan sebagian besar area masih ditandai dengan hilangnya organisasinya (lingkaran), beberapa hepatosit yang tampak normal (panah) sementara sebagian besar hepatosit terungkap dengan degenerasi hidropik (panah melengkung), dilatasi sedang, kongesti (bintang), dan hialinisasi vena porta (persegi panjang), agregasi sedang sel-sel inflamasi (panah gelombang), serta beberapa sinusoid hati yang utuh dan mayoritas ditunjukkan dalam penampilan yang mengalami atrofi (kepala panah)

4 Diskusi
Hepatotoksisitas yang disebabkan oleh bahan kimia bergantung pada beberapa faktor, seperti konsentrasi zat beracun, ekspresi enzim tertentu, dan gradien konsentrasi zat tersebut dalam darah yang mengelilingi asinus (Pervez 2020 ). Melamin menunjukkan efek toksik pada jaringan hati (Erisgin et al. 2021 ). Telah diamati bahwa melamin, baik sendiri maupun bersama dengan asam sianurat, dapat menyebabkan lesi hati patologis pada tikus (Erisgin et al. 2021). ).

Ditemukan bahwa cobroxin dan nyloxin, dua analgesik, hadir dalam racun kobra Mesir. Nyloxin bermanfaat dalam mengobati nyeri artritis yang parah, sementara cobroxin bekerja mirip dengan morfin dengan memblokir transmisi saraf (Chang et al. 2021 ). Efektivitas sebagai antikoagulan telah ditunjukkan untuk senyawa Arvin, yang diekstrak dari ular berbisa Malaya. Enzim yang disebut fosfolipase A 2 mampu menghidrolisis fosfolipid, yang dapat diarahkan ke permukaan sel bakteri dan memiliki kualitas antimikroba baru (Estevão-Costa et al. 2018 ). Banyak protein yang ditemukan dalam racun ular telah lama diketahui memiliki kualitas analgesik (Bocian dan Hus 2020 ); tantangan utamanya adalah memasukkan protein ke dalam sel saraf secara efisien. Juga digunakan dalam pengobatan kanker tulang dan payudara (Mohamed Abd El-Aziz 2019 ).

Dalam hasil kami, melamin secara signifikan menurunkan kadar HB rata-rata, jumlah sel darah merah, jumlah neutrofil, dan jumlah monosit, sementara jumlah PLT, jumlah sel darah putih, dan sel limfosit meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol. Temuan ini memastikan temuan para peneliti yang menemukan bahwa, dibandingkan dengan kontrol, melamin secara signifikan menurunkan nilai sel darah merah, HB, HCT, MCV, dan MCHC; dengan demikian, paparan melamin memengaruhi fungsi hematopoietik tubuh dan menyebabkan peningkatan jumlah sel darah putih yang mencerminkan status inflamasi (Liu et al. 2022 ). Selain itu, temuan kami menguatkan temuan peneliti lain yang menemukan bahwa melamin secara signifikan mengurangi nilai rata-rata sel darah merah, Hb, dan MCHC pada kelompok melamin jika dibandingkan dengan kelompok kontrol dan dapat meningkatkan risiko kelainan sel darah merah (Abd-Elhakim et al. 2016). ).

Melamin (MEL) dapat dikaitkan dengan ekspresi protein abnormal dan pecahnya membran sel dalam kaitannya dengan parameter darah standar. Studi menyatakan bahwa MEL menyebabkan resistensi osmotik membran dan aktivitas ATPase Na + / K + berkurang, sehingga melemahkan integritas membran sel dan berpotensi merusak membran sel darah (Strakova et al. 2014) ).

Pemberian bisa ular kobra mengakibatkan peningkatan jumlah RBC, HB, total WBC, dan MCHC, serta penurunan jumlah neutrofil dan monosit.

Studi saat ini menunjukkan bahwa paparan melamin mungkin telah memfasilitasi pelepasan enzim hati AST, ALT, D, dan T bilirubin dari sirkulasi, yang menyebabkan peningkatan kadar serum. Temuan ini mendukung laporan sebelumnya (Aboubakr et al. 2021 ; Ahmed et al. 2021 ; Ahmed et al. 2022 ) yang menunjukkan peningkatan kadar enzim hati. Selain itu, ada juga laporan tentang degradasi membran hepatosit yang nyata disertai dengan peningkatan aktivitas enzim hati, yang mengonfirmasi gangguan fungsi hati yang signifikan setelah paparan melamin (El Rabey et al. 2014 ; Early et al. 2013 ). Hasil ini konsisten dengan data histoarsitektur kami, yang menunjukkan perubahan patologis yang signifikan pada jaringan hati, termasuk kerusakan membran hepatosit yang signifikan.

Lebih jauh lagi, setelah terpapar melamin, para peneliti melihat struktur hati terganggu dan agregat hati terbentuk (Melekoğlu et al. 2020 ). Penelitian sebelumnya juga telah melaporkan pengamatan ini (Chang et al. 2021 ; Ahmed et al. 2022 ) yang membuktikan tanpa keraguan bahwa melamin merusak jaringan hati tikus. Temuan penelitian saat ini menunjukkan kemanjuran terapeutik pemberian racun kobra Mesir terhadap disfungsi hati yang disebabkan melamin dengan meningkatkan aktivitas protein T dan albumin serta menurunkan aktivitas AST, ALT, T. bilirubin, dan D. bilirubin.

Melalui inaktivasi substrat dan produksi molekul sinyal aktif, keluarga endoprotease caspase menginduksi peradangan dan apoptosis (He et al. 2021 ). Kematian sel intrinsik (dimediasi oleh mitokondria) dan eksternal (eksternal) umumnya terlibat dalam apoptosis sel (Yang et al. 2022 ). Caspase-3 adalah caspase eksekutor penting dalam apoptosis. Setelah diaktifkan, ia membelah berbagai substrat seluler, yang menyebabkan pembongkaran dan kematian sel yang terkendali. Setelah diaktifkan, caspase-3 membelah banyak substrat, yang mengakibatkan kerusakan seluler: Pembelahan PARP (Poli ADP-Ribosa Polimerase) → Mencegah perbaikan DNA, Degradasi ICAD (Penghambat DNase yang Diaktifkan Caspase) → Melepaskan CAD (DNase yang Diaktifkan Caspase), yang mengakibatkan fragmentasi DNA dan Kerusakan sitoskeletal dan nuklir → Pembelahan aktin, lamin, dan gelsolin mengganggu struktur sel.

Peristiwa ini mengakibatkan penggumpalan membran, kondensasi kromatin, dan pembentukan badan apoptosis, yang mengarah pada pembersihan fagositosis. Sebaliknya, sejumlah stresor seluler, termasuk UV dan stres oksidatif, dapat memicu apoptosis sel intrinsik dengan mengatur Bcl2 secara negatif, meningkatkan translokasi Bax ke mitokondria, dan menyebabkan kerusakan pada membran mitokondria. Bax adalah anggota pro-apoptotik utama dari keluarga Bcl-2 yang terlibat dalam apoptosis yang dimediasi mitokondria. Dalam kondisi normal, Bax terutama terletak di sitosol dalam bentuk monomerik yang tidak aktif, terikat pada protein anti-apoptotik seperti Bcl-2 dan Bcl-xL. Setelah menerima sinyal pro-apoptotik (misalnya, kerusakan DNA, penarikan faktor pertumbuhan, stres oksidatif), Bax mengalami perubahan konformasi dan bertranslokasi ke membran mitokondria luar (OMM). Aktivasi ini dipicu oleh protein BH3-only seperti Bid, Bim, atau Puma, yang melepaskan Bax dari interaksi penghambatan. Begitu berada di membran mitokondria, Bax mengalami oligomerisasi dan menyisipkan ke dalam OMM. Hal ini menyebabkan permeabilisasi membran luar mitokondria (MOMP), langkah kunci dalam apoptosis. Bax membentuk pori-pori atau saluran di membran, yang memungkinkan pelepasan sitokrom c dan faktor pro-apoptotik lainnya. Sitokrom c dilepaskan dari mitokondria ke dalam sitoplasma. Ia mengikat Apaf-1 (faktor pengaktif protease apoptosis-1), membentuk apoptosom. Apoptosom mengaktifkan kaspase-9, yang selanjutnya mengaktifkan kaspase-3 dan kaspase-7, yang menyebabkan pembongkaran sel dan apoptosis (Yang et al. 2022 ). Temuan penelitian saat ini menunjukkan bahwa hepatotoksisitas yang diinduksi melamin terkait dengan apoptosis hati intrinsik dan ekstrinsik. Hal ini didukung oleh peningkatan yang diamati dalam transkripsi Bax, penurunan caspase-3, enzim antiapoptotik, dan penurunan bersamaan dalam tingkat mRNA Bcl2. Penulis lain juga menunjukkan hasil serupa, yang mengonfirmasi bahwa kematian sel intrinsik (Habotta, Ateya, et al. 2023 ; Alsharif et al. 2023 ).

Tingkat hepatotoksisitas dibandingkan dengan kelompok kontrol dievaluasi dengan menilai apoptosis, penanda non-apoptosis BAX, dan caspase-3, berdasarkan temuan yang diperoleh. Jika dibandingkan dengan kelompok kontrol, kadar BAX secara signifikan lebih tinggi pada kelompok melamin (Knittel et al. 1999 ). Dalam penyelidikan ini, kadar BAX kelompok yang diobati lebih rendah daripada kelompok melamin. Selain itu, kadar Caspase-3 aktif kelompok yang diobati lebih tinggi daripada kelompok melamin. Ketika antigen protein memasuki tubuh, respons imun—proses yang sangat kompleks dan teratur—dipicu. Hati pernah dianggap sebagai organ non-imunologis yang terutama digunakan untuk fungsi metabolisme, penyimpanan nutrisi, dan detoksifikasi. Namun, penemuan baru telah mengungkapkan bahwa hati yang sehat juga merupakan lokasi aktivitas kekebalan yang rumit, yang dikendalikan oleh beragam sel kekebalan yang bertanggung jawab atas respons inflamasi dan anti-inflamasi (Strakova et al. 2014 ; Aboubakr et al. 2021). ).

Penanda anti-apoptotik dan inflamasi meningkat pada melamin (Robinson et al. 2016 ). Peningkatan produksi sitokin pro-inflamasi dan mekanisme sel inflamasi penting yang terlibat dalam hepatotoksisitas melamin telah dikaitkan dengan cedera hati yang disebabkan oleh metamin (Yang et al. 2022 ; Habotta, Ateya, et al. 2023 ). Hasil ini konsisten dengan hasil imunohistokimia kami, yang menunjukkan peningkatan ekspresi penanda inflamasi pada jaringan hati, dan hasil histopatologi kami, yang menjelaskan infiltrasi sel inflamasi. Faktor transkripsi menarik yang dikenal sebagai penanda inflamasi terlibat dalam regulasi mediator pro-inflamasi, ekspresi kemokin, dan aktivasi sitokin (Habotta, Abdeen, et al. 2023 ). Temuan serupa telah dilaporkan mengenai peningkatan regulasi ekspresi inflamasi pada tikus yang telah diberi melanin (Yang et al. 2022 ). Dalam penelitian ini, kelompok yang diobati menunjukkan konsentrasi penanda inflamasi yang lebih tinggi seperti IL-2, IL-10, dan INF-γ, yang menunjukkan perbaikan pada jaringan hati. Sitokin yang sangat anti-inflamasi seperti IL-2, IL-10, dan IFN-ℽ hadir dalam kelompok melamin hepatotoksisitas dalam percobaan ini, tetapi menurun setelah pengobatan dengan racun kobra Mesir. Peningkatan kadar IL-2 dan IL-10 secara signifikan meningkatkan aktivasi limfosit T dalam hepatotoksisitas (Ahmed et al. 2022 ). Interleukin-2 (IL-2) adalah sitokin yang memainkan peran penting dalam regulasi sistem imun, terutama dalam proliferasi, kelangsungan hidup, dan diferensiasi sel T. IL-2 terutama diproduksi oleh sel T CD4 + yang diaktifkan , meskipun CD8 + dan sel pembunuh alami (NK) juga dapat memproduksinya. Ekspresinya dipicu oleh stimulasi antigen melalui reseptor sel T (TCR) dan sinyal kostimulasi, terutama CD28. Transkripsi IL-2 diatur oleh faktor transkripsi seperti NF-κB, AP-1, dan NFAT. Setelah IL-2 mengikat reseptor afinitas tinggi (IL-2Rα/β/γc), IL-2 memicu pensinyalan intraseluler melalui jalur JAK–STAT, PI3K-Akt, dan MAPK yang menyebabkan proliferasi sel T, pemeliharaan sel T regulator (Treg) yang penting untuk toleransi imun dan pencegahan autoimunitas, pembentukan sel T memori yang mendukung respons imun jangka panjang, dan aktivasi sel T sitotoksik (CTL) dan sel NK.

Interleukin-10 (IL-10) adalah sitokin antiinflamasi yang berperan penting dalam pengaturan imun, penekanan inflamasi, dan homeostasis jaringan. Ia diproduksi terutama oleh sel T regulator (Treg), monosit, makrofag, dan sel B. IL-10 menghambat produksi TNF-α, IL-6, IL-12, dan IFN-γ oleh makrofag dan sel dendritik. Ia menurunkan regulasi NF-κB, mencegah transkripsi gen inflamasi. Selain itu, IL-10 meningkatkan diferensiasi sel Treg Foxp3+. Treg menekan aktivasi imun yang berlebihan, mencegah autoimunitas. Oleh karena itu, IL-10 membatasi kerusakan imun yang berlebihan pada infeksi dan inflamasi kronis serta mendukung perbaikan jaringan dan penyembuhan inflamasi.

Interferon-gamma (IFN-γ) adalah sitokin proinflamasi yang berperan penting dalam respons imun terhadap infeksi, imunitas tumor, dan regulasi autoimun. Ia diproduksi terutama oleh sel T (sel T sitotoksik CD4 + Th1 dan CD8 + ) dan sel pembunuh alami (NK). IFN-γ mengikat reseptor IFN-γ (IFNGR), yang diekspresikan pada hampir semua sel berinti, terutama makrofag, sel dendritik (DC), dan sel epitel, yang menyebabkan Aktivasi JAK–STAT yang menginduksi produksi ROS dan NO, meningkatkan pembunuhan mikroba, dan meningkatkan regulasi MHC Kelas II dan CD80/CD86, yang meningkatkan aktivasi sel T. Ini adalah proses bertingkat yang mungkin juga sebagian bergantung pada sintesis lokal anti-sitokin kemoatraktan (IFN-γ) atau kemokin, yang mengendalikan fungsi reseptor adhesi permukaan sel dan memandu migrasi sel target ke lokasi jaringan (Fatima dan Fatah 2014 ). Lebih jauh lagi, peningkatan ekspresi gen kemokin pro-inflamasi dicatat dalam kasus kerusakan hati (Doumas et al. 1981 ). Dalam penyelidikan saat ini, tikus diberi melamin untuk menyebabkan kerusakan hati yang ireversibel. Kerusakan hati diindikasikan oleh peningkatan kadar sitokin fase akut, seperti IFN-γ, IL-2, dan IL-10, seperti yang dilaporkan dalam penelitian (Erisgin et al. 2021 ). Enzim hati, sitokin pro-inflamasi, dan penanda inflamasi semuanya seimbang pada mereka yang menerima pengobatan dari bisa ular kobra Mesir. Temuan penelitian terkini mengenai perubahan histopatologi mengungkapkan bahwa tikus yang diberi melamin menunjukkan berbagai perubahan degeneratif hepatosit, termasuk sel yang membesar. Sel-sel tersebut tampak seperti berbusa dan ringan. Vakuola, atau beberapa ruang yang ditempati oleh sel, terlihat dalam sitoplasma. Dilatasi pembuluh darah juga menyebabkan nekrosis pada beberapa sel hati yang memiliki kromatin yang padat dan nuklei kecil yang psikotik. Hasilnya menguatkan temuan (Pervez 2020 ), yang menyatakan bahwa melamin mengakibatkan infiltrasi limfosit masif, perubahan nekrotik, degenerasi jaringan hati, dan perubahan lemak yang signifikan. Lebih lanjut, (Abd-Elhakim et al. 2016 ). Sebaliknya, ada lebih sedikit perubahan nekrotik dan degenerasi jaringan hati pada kelompok yang diobati.

5 Kesimpulan
Dalam pengobatan hepatotoksisitas akibat melamin, pengobatan dengan (melamin + SV10 ug/kg) memiliki efek perlindungan. Dapat disimpulkan dari data eksperimen terkini bahwa jaringan hati tikus yang terlindungi dapat menahan konsentrasi racun kobra (SV10 μg/kg) lebih aman daripada SV20 μg/kg.