Abstrak
Konsentrat protein whey (WPC) mengalami mikrofiltrasi (MF) untuk menghasilkan isolat protein whey (WPI), menghasilkan retentat MF bernilai lebih rendah sebagai produk sampingan. Retensi protein yang lebih tinggi dari yang diharapkan dalam retentat, yang dikaitkan dengan agregasi protein, telah terbukti membatasi hasil WPI. Strategi untuk membalikkan atau mengurangi agregasi diharapkan dapat meningkatkan transmisi protein selama MF. Studi ini menyelidiki efek pra-perlakuan WPC dengan 5 mM trisodium sitrat (TSC), garam pengikat kalsium dan homogenisasi tekanan tinggi (HPH) pada 650 bar, baik secara individu maupun dalam kombinasi, pada transmisi protein selama MF. Larutan WPC (protein 2,4%) dipra-perlakuan dengan TSC, HPH, TSC diikuti oleh HPH (TSC + HPH), atau HPH diikuti oleh TSC (HPH + TSC). Mikrofiltrasi dilakukan dengan menggunakan membran polietersulfon 1000 kDa. Waktu pemrosesan, pembagian komponen dan komposisi kimia dalam umpan, retentat dan permeat dianalisis. Profil protein dinilai menggunakan SDS-PAGE dan RP-HPLC, selain denaturasi protein whey. Data diperoleh dari tiga uji coba independen, dengan semua analisis dilakukan dalam rangkap tiga. Perlakuan secara signifikan mengurangi waktu pemrosesan dan meningkatkan permeasi protein ( P  < 0,05). Waktu pemrosesan menurun sebesar 6,4–11,0%, dengan TSC dan HPH memiliki efek terkuat. Dibandingkan dengan kontrol, retensi protein dalam retentat MF dari sampel yang telah diolah sebelumnya menurun sebesar 7,5–11,5%, dengan HPH + TSC menunjukkan efek terbesar, sementara kandungan protein permeat meningkat sebesar 5,45–9,64% ( P  < 0,05). SDS-PAGE mengonfirmasi tingkat agregasi protein yang lebih rendah, khususnya pada HPH + TSC, bertepatan dengan tingkat protein sedimen terendah (43,4%). Sampel yang telah diolah dengan trisodium sitrat menunjukkan kadar kalsium dan magnesium yang secara signifikan lebih rendah ( P  < 0,05), yang memberikan bukti bahwa kation terlibat dalam mediasi agregasi protein. Hasilnya menunjukkan bahwa pengolahan WPC dapat memodifikasi permeasi protein, meningkatkan hasil WPI sekaligus menghasilkan retentat MF yang diperkaya lebih lanjut dalam lipid polar, yang mendukung pengolahan susu yang lebih berkelanjutan.

PERKENALAN
Mikrofiltrasi (MF) konsentrat protein whey (WPC) merupakan pendekatan teknologi yang mapan untuk memproduksi aliran protein dengan kemurnian tinggi (Price 2019 ; Carter et al . 2021 ). Proses MF tersebut menggunakan membran dengan ukuran pori 0,1–1,0 μm, yang dirancang untuk menahan protein whey yang teragregasi, lemak sisa, dan fragmen membran globula lemak susu (MFGM) dalam retentat. Aliran permeat diproses lebih lanjut menjadi isolat protein whey (WPI), sementara aliran retentat mengalami pemrosesan lebih lanjut untuk membuat konsentrat fosfolipid protein whey (WPPC), yang juga dikenal sebagai WPC berlemak tinggi (HFWPC) (ADPI 2023 ). Penelitian kami sebelumnya (Mestawet et al . 2024 ) telah menunjukkan tingkat retensi protein yang tinggi dalam retentat MF tersebut, yang sejalan dengan penelitian lain yang melaporkan temuan serupa untuk WPPC (Levin et al . 2016 ; Ozturk et al . 2022 ). Retensi protein yang tinggi kemungkinan besar disebabkan oleh agregasi protein whey yang disebabkan oleh panas selama produksi WPC (Dissanayake dan Vasiljevic 2009 ; Ma et al . 2015 ; Munir et al . 2019 ; Zhang et al . 2021 ).

Perlakuan panas mengubah struktur protein whey, terutama untuk protein dengan gugus sulfhidril bebas (Wang dan Lucey 2003 ; Barone et al . 2020 ; Laursen et al . 2023 ), yang menyebabkan denaturasi dan paparan gugus tiol reaktif, yang dapat berinteraksi dengan gugus tiol pada protein lain, sehingga mengakibatkan terbentuknya ikatan disulfida (Čurlej et al . 2022 ). Hal ini menyebabkan terjadinya pelipatan, ikatan silang, agregasi, oksidasi dan reaksi Maillard (Singh dan Creamer 1991 ; Zhang et al . 2021 ; Coşkun et al . 2023 ). Selain itu, ion kalsium (Ca2 + ) dapat meningkatkan agregasi β-laktoglobulin (β-lg) melalui interaksi elektrostatik (Fox et al . 2015 ; Joyce et al . 2017 ; Laursen et al . 2023 ). Lebih jauh lagi, gumpalan lemak susu asli dan fragmen MFGM, yang terdapat dalam retentat WPC, menyediakan daerah hidrofobik dan situs reaktif yang memfasilitasi agregasi protein (Ozturk et al . 2022 ). Secara khusus, protein whey yang terdenaturasi berinteraksi dengan daerah hidrofobik dari gumpalan dan fragmen lemak ini, sementara gugus tiol yang terekspos membentuk ikatan disulfida, yang menghasilkan ikatan silang kovalen. Modifikasi struktural ini meningkatkan ukuran partikel, sehingga meningkatkan retensi protein dalam retentat MF (Nuzzo et al . 2017 ; Guralnick et al . 2021 ). Selain itu, agregasi protein dan partikel yang lebih besar yang dihasilkan berkontribusi terhadap pengotoran membran, yang mengakibatkan penurunan fluks permeat selama MF.

Meskipun teknik pengolahan susu dan whey nontermal, termasuk pengolahan bertekanan tinggi dan medan listrik berdenyut, telah maju dalam beberapa tahun terakhir (Bevilacqua et al . 2019 ; Munir et al . 2019 ), pengolahan termal tetap menjadi teknologi yang paling banyak digunakan. Dengan aplikasi HFWPC/WPPC saat ini yang terbatas terutama pada pakan ternak (misalnya pengganti susu) dan produk gula-gula, retensi protein tinggi dalam retentat MF menghadirkan peluang untuk penciptaan nilai lebih lanjut di kedua aliran (yaitu WPPC dan WPI). Mengurangi atau membalikkan agregasi protein berpotensi meningkatkan transmisi protein selama MF, memungkinkan pengayaan MFGM dan fosfolipid (PL) yang lebih besar dalam retentat MF yang dihasilkan, sementara juga meningkatkan hasil WPI, bahan bernilai tinggi. Meskipun potensinya, sedikit penelitian telah dipublikasikan tentang pendekatan untuk meningkatkan transmisi protein dengan mengurangi agregasi. Berdasarkan pertimbangan ini, penulis melakukan uji coba pendahuluan untuk menyelidiki interaksi kimia dalam matriks protein agregat, mengikuti pendekatan yang diuraikan oleh Laursen et al . ( 2023 ). Uji coba ini melibatkan pra-perlakuan pakan WPC dengan berbagai bahan kimia, termasuk tris, natrium dodecyl sulphate, dithiothreitol dan asam ethylenediaminetetraacetic (EDTA), untuk mengeksplorasi potensinya dalam mengganggu agregat protein. Selain itu, metode fisik seperti homogenisasi pada tekanan yang berbeda (350, 500 dan 650 bar) dan pencampuran geser tinggi dari pakan WPC diuji sebagai pendekatan perlakuan untuk mengevaluasi dampaknya pada disagregasi dan permeasi protein. Setelah menerapkan metode kimia dan fisik, ukuran partikel diukur, dan mikroskopi pemindaian laser confocal dilakukan untuk menilai perubahan ukuran partikel. Perlakuan kimia menunjukkan bahwa interaksi ionik memainkan peran penting dalam agregasi protein, sejalan dengan temuan kami sebelumnya tentang konsentrasi tinggi ion divalen (Ca 2+ dan magnesium, Mg 2+ ) dalam aliran retentat MF (Mestawet et al . 2024 ). Uji coba pendahuluan menggunakan homogenisasi tekanan tinggi (HPH) menunjukkan pengurangan ukuran partikel yang signifikan, konsisten dengan penelitian lain yang melaporkan bahwa HPH mengurangi ukuran partikel dalam larutan/dispersi protein susu (D’Incecco et al . 2018 ; Warncke dan Kulozik 2020 ; Hebishy et al . 2022 ), sedangkan pencampuran geser tinggi tidak menunjukkan efek tersebut. Silakan lihat Gambar tambahan ( S1 ) untuk informasi lebih lanjut.

Dalam percobaan saat ini, trisodium sitrat (TSC), garam pengikat kalsium tingkat pangan, dipilih, bersama dengan HPH, sebagai pendekatan untuk pengolahan. Trisodium sitrat, yang umum digunakan sebagai bahan tambahan pangan dan agen penyangga, mengikat kalsium dan kation divalen lainnya, sehingga mencegah agregasi protein yang dimediasi kation dan meningkatkan kelarutan protein (McCarthy et al . 2017 ; Hebishy et al . 2019 ). Demikian pula, HPH mengurangi ukuran partikel dan meningkatkan stabilitas produk dengan memecah agregat protein menjadi partikel yang lebih kecil atau molekul individu, memfasilitasi dispersi yang lebih baik (D’Incecco et al . 2018 ). Berdasarkan sifat-sifat ini, penelitian ini dirancang untuk menyelidiki efek pra-perlakuan WPC dengan TSC dan HPH, baik secara individu maupun dalam kombinasi, pada peningkatan transmisi protein selama MF. Hasil penelitian ini akan menjadi penting untuk menciptakan nilai tambah dan mengidentifikasi peluang pemanfaatan yang lebih baik untuk aliran retentat MF yang kurang dimanfaatkan dan kurang dihargai.

BAHAN DAN METODE
Bahan, reagen kimia dan perawatan
Bubuk konsentrat protein whey disediakan oleh perusahaan susu lokal Irlandia (Carbery Group, Ballineen, Co. Cork, Irlandia). Semua bahan kimia, reagen, dan standar untuk kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), kecuali dinyatakan lain, diperoleh dari Sigma-Aldrich (Wicklow, Irlandia) dan bermutu analitis.

Persiapan dan perawatan sampel
Desain eksperimen mencakup kontrol dan empat perlakuan, yang dirancang untuk mengevaluasi dampak pendekatan perlakuan individual dan gabungan, dalam urutan yang berbeda, pada disagregasi protein dan permeasi berikutnya selama MF. Umpan WPC yang direkonstitusi disiapkan dengan mencampur bubuk dengan air ultramurni pada suhu 50°C dan diaduk selama 3 jam menggunakan dayung tiga bilah yang dipasang pada pengaduk atas (IKA ® EUROSTAR 60 digital, Jerman) pada 300 rpm untuk mencapai larutan protein 2,4% (b/v). Larutan WPC yang direkonstitusi (pH disesuaikan menjadi 6,4 pada suhu 22°C) kemudian dipertahankan pada suhu 4°C semalaman, dengan pengadukan terus-menerus pada kecepatan 200 rpm untuk memastikan rehidrasi lengkap, yang mewakili kontrol (CTRL). Untuk Perlakuan 1 (TSC), setelah merekonstitusi umpan WPC selama 3 jam sesuai CTRL, 5 mM TSC ditambahkan, dan pH disesuaikan kembali menjadi 6,4 pada suhu 22°C. Sampel selanjutnya diaduk selama 2 jam tambahan dan kemudian dipertahankan pada suhu 4 ° C semalaman dengan pengadukan terus-menerus pada 200 rpm. Perlakuan ini bertujuan untuk mengevaluasi efek penambahan TSC pada disagregasi protein dan permeasi berikutnya selama MF. Untuk perlakuan HPH, sampel kontrol dilewatkan melalui homogeniser katup dua tahap (APV 1000, SPX Flow, Charlotte, NC, AS) dalam satu lintasan pada tekanan total 650 bar, dengan 500 bar diterapkan pada tahap pertama dan 150 bar pada tahap kedua; perlakuan ini dirancang untuk menilai efek gangguan fisik pada agregat protein tanpa perlakuan kimia apa pun. Perlakuan 3 (TSC + HPH) melibatkan persiapan sampel seperti untuk perlakuan TSC, diikuti oleh HPH pada 650 bar pada hari berikutnya. Perlakuan HPH + TSC melibatkan mengikuti langkah-langkah persiapan yang sama seperti untuk CTRL, diikuti oleh penerapan HPH pada 650 bar, dan kemudian menambahkan 5 mM TSC pada 22 ° C; sampel selanjutnya dipertahankan pada suhu 4°C semalaman dengan pengadukan terus-menerus pada 200 rpm. Perlakuan berurutan dalam TSC + HPH dan HPH + TSC dirancang untuk menilai dampak gabungan TSC dan HPH pada disosiasi agregat protein, dan akhirnya, permeasi protein. Homogenisasi mengganggu agregat protein melalui gaya mekanis, yang berpotensi mengekspos situs reaktif yang terkubur dalam agregat. Penambahan TSC berikutnya dalam HPH + TSC berpotensi meningkatkan kemampuannya untuk mengakses dan mengkelat situs yang terekspos ini, yang mendorong disagregasi lebih lanjut. Ini bertujuan untuk menentukan apakah urutan penambahan TSC, baik setelah atau sebelum homogenisasi, akan lebih efektif meningkatkan disagregasi protein dan meningkatkan permeasi selama MF.

Pengaturan mikrofiltrasi
Perangkat filtrasi aliran tangensial bertekanan skala laboratorium (Pellicon 2 mini-holder; Merck Millipore, Tullagreen, Carrigtwohill, Irlandia) digunakan mengikuti prosedur yang diuraikan oleh France et al . ( 2021a ) untuk melakukan tiga eksperimen MF independen, yang masing-masing terdiri dari kontrol dan empat perlakuan. Kartrid membran polietersulfon (PES), V-screen, batas berat molekul 1000 kDa (Biomax, Merck Millipore) dengan luas membran 0,1 m 2 digunakan. Pompa peristaltik (Watson-Marlow 520S, Watson-Marlow Pumps Group, Falmouth, Cornwall TR11 4RU, Inggris), yang beroperasi pada 90 rpm, digunakan untuk mengalirkan umpan WPC melalui sistem filtrasi.

Setelah merakit unit penyaringan, 5 L air deionisasi pada suhu 50°C dialirkan melalui sistem untuk membuang larutan penyimpanan yang tersisa dari membran. Selanjutnya, 3 L umpan WPC dipompa melalui unit penyaringan, membuang bahan permeat dan retentat awal hingga semua air yang tersisa dibuang. Umpan kemudian disirkulasikan melalui unit penyaringan di bawah mode resirkulasi total, dengan saluran retentat dan permeat dikembalikan ke bejana umpan, hingga suhu dan tekanan stabil tercapai. Selama MF, aliran retentat terus-menerus dialirkan kembali ke bejana umpan, sementara permeat dikumpulkan hingga faktor konsentrasi volume (VCF) tercapai sebesar 6. MF dilakukan pada kecepatan pompa 90 rpm dan tekanan transmembran awal (TMP) sebesar 0,55 bar. Suhu di seluruh MF dipertahankan pada 12,8 ± 1°C menggunakan penangas air (Grant LT ecocool 100, Inggris) yang terhubung ke penukar panas pelat (Complete Stainless Engineering Ltd, Limerick, Irlandia) yang dihubungkan ke jalur retentat. Dari setiap perlakuan, tiga jenis sampel diperoleh: umpan WPC, retentat MF, dan permeat MF. Setelah setiap uji coba MF untuk setiap perlakuan, permeabilitas air yang dinormalisasi (NWP) dari membran diukur (lihat bagian Analisis dalam proses ). Untuk memastikan konsistensi eksperimental dan menghindari kontaminasi silang, sistem filtrasi dibersihkan secara menyeluruh setelah setiap uji coba mengikuti protokol yang diuraikan oleh Crowley et al . ( 2015 ). Langkah pembersihan ini sangat penting karena pengotoran pada membran, yang disebabkan oleh agregat protein dan partikulat lain selama MF, mengurangi fluks permeat seiring waktu. Penghapusan bahan pengotoran dan pemulihan kinerja membran sangat penting untuk mendapatkan hasil yang akurat dan dapat direproduksi untuk setiap perlakuan.

Analisis dalam proses
Fluks permeat (L/m 2 /jam), TMP, pH dan konduktivitas diukur menurut metode yang diuraikan oleh Mestawet et al . ( 2024 ). NWP dan pengotoran membran dinilai mengikuti pendekatan yang dijelaskan oleh France et al . ( 2021a ).

Komposisi kimia kotor
Total padatan (TS), abu, protein dan kandungan lemak dalam sampel ditentukan dengan mengikuti metode standar (AOAC International 2000 ; IDF 2001 , 2008 , 2010 ). TS, protein dan partisi lemak antara retentat dan permeat selama MF dihitung sebagai persentase kandungan dalam umpan WPC.

Analisis profil mineral
Analisis profil mineral sampel dilakukan menggunakan spektrometri massa plasma yang diinduksi (ICP-MS) setelah pencernaan berbantuan gelombang mikro dengan Mars Express Digester (MARS 6®, CEM Microwave Technology Ltd.) sebagaimana diuraikan dalam pedoman Organisasi Internasional untuk Standardisasi ( 2013 ), sebagaimana dijelaskan sebelumnya oleh Mestawet et al . ( 2024 ). Mineral yang dianalisis meliputi kalsium (Ca), fosfor (P), magnesium (Mg), natrium (Na), kalium (K) dan klorida (Cl).

Analisis profil protein
Elektroforesis gel poliakrilamid-natrium dodecyl sulfat
Profil protein dari sampel dianalisis menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid-natrium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) mengikuti metode Laemmli ( 1970 ), dengan penyesuaian kecil seperti yang dijelaskan oleh Mestawet et al . ( 2024 ). Gel umpan, yang terdiri dari sampel umpan dari semua perlakuan, dimuat dengan 10 μL sampel pada konsentrasi protein 1 mg/mL dan dengan 5 μL standar protein rentang luas SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA) yang berfungsi sebagai penanda berat molekul. Untuk menilai efek perlakuan umpan WPC pada partisi protein antara aliran retentat MF dan permeat, sampel kontrol dimuat dengan 10 μL sampel pada konsentrasi protein 1 mg/mL. Namun, sampel yang telah diolah terlebih dahulu dimuat menggunakan volume yang sama (10 μL) seperti kontrol, tanpa menstandardisasi konsentrasi proteinnya menjadi 1 mg/mL. Pendekatan ini secara khusus dipilih untuk menekankan perbedaan intensitas pita pada gel SDS-PAGE, memberikan representasi visual tentang bagaimana perawatan memengaruhi partisi protein, terlepas dari penyesuaian konsentrasi protein standar.

Kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik
Profil protein dari semua sampel dianalisis lebih lanjut menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik (RP-HPLC) dengan sistem Agilent 1220 Infinity II LC mengikuti protokol yang sebelumnya dijelaskan oleh Mestawet et al . ( 2024 ).

Denaturasi protein whey
Tingkat denaturasi protein whey dinilai dengan menghitung perbedaan antara kandungan nitrogen dari fraksi protein terlarut pada pH 4,6 dan kandungan nitrogen dari sampel asli masing-masing, mengikuti metodologi yang diuraikan oleh O’Kennedy dan Mounsey ( 2006 ) dan Schmidmeier et al . ( 2019 ). Kandungan nitrogen dari fraksi terlarut pH 4,6 ditentukan mengikuti metode standar IDF ( 2008 ).

Analisis distribusi ukuran partikel
Distribusi ukuran partikel dalam semua sampel dianalisis menggunakan hamburan cahaya dinamis (DLS) dengan instrumen Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, Inggris), dilengkapi dengan tempat penyimpanan sel yang suhunya terkontrol, sesuai dengan protokol yang sebelumnya dijelaskan oleh Mestawet et al . ( 2024 ). Data ukuran partikel dilaporkan sebagai nilai yang dibobot berdasarkan intensitas (rata-rata Z).

Analisis statistik
Semua sampel berasal dari tiga uji coba independen, dan semua analisis dilakukan dalam rangkap tiga. Data eksperimen yang diperoleh dianalisis menggunakan rancangan acak lengkap dengan menggunakan prosedur ANOVA satu arah GLM melalui program perangkat lunak komputer Statistical Analysis System (SAS Institute Inc 2008 ), versi 9.1.3. Perbedaan yang signifikan secara statistik antara rata-rata ditentukan menggunakan uji post hoc Tukey’s HSD, dengan tingkat kepercayaan 95%.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Kinerja proses mikrofiltrasi
Selama MF, pengukuran in-line diambil untuk menilai kinerja proses MF. Di tiga uji coba independen, suhu dipertahankan pada 12,8 ± 1°C. Perlakuan umpan WPC secara signifikan mengurangi ( P  < 0,05) pengotoran membran, sebagaimana dibuktikan oleh pengurangan NWP yang lebih kecil untuk semua perlakuan dibandingkan dengan CTRL (yang menunjukkan pengurangan NWP sebesar 47,3% setelah MF); selain itu, CTRL memerlukan waktu pemrosesan yang secara signifikan lebih lama ( P  < 0,05) untuk mencapai VCF yang diinginkan sebesar 6 dibandingkan dengan sampel yang telah diolah terlebih dahulu (Tabel 1 ). Efek ini tercermin dalam fluks permeat untuk CTRL, yang menurun dari 32,0 menjadi 18,1 L/m 2 /jam (Gambar 1 ), dengan peningkatan yang sesuai dalam TMP dari awal 0,55 bar menjadi akhir 1,1 bar. Sebagai perbandingan, nilai fluks awal dan akhir untuk TSC, HPH, TSC + HPH dan HPH + TSC masing-masing adalah 31,6–22,2, 33,6–20,0, 34,8–20,4 dan 30,8–19,6 L/m 2 /jam, dengan TMP akhir yang sebanding sekitar 0,8 bar. Hasilnya menunjukkan bahwa perlakuan WPC meningkatkan fluks permeat dan mengurangi pengotoran. Tinjauan tentang pengotoran yang disebabkan protein dalam ultrafiltrasi dan MF menyoroti bahwa agregasi protein meningkatkan pengotoran dengan melekat pada permukaan membran dan menyumbat pori-pori, yang menyebabkan kinerja membran berkurang (Tanudjaja et al . 2022 ).

Tabel 1. Pengurangan permeabilitas air yang dinormalisasi dan waktu pemrosesan untuk menghasilkan 2,5 L permeat setelah mikrofiltrasi pakan konsentrat protein whey dengan perlakuan berbeda pada suhu 12,8 ± 1°C.

CTRL, kontrol pakan konsentrat protein whey (WPC); HPH + TSC, pakan WPC yang telah diolah terlebih dahulu dengan homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar diikuti oleh trisodium sitrat; HPH, pakan WPC dihomogenisasi pada 650 bar; NWP, Permeabilitas air yang dinormalisasi; TSC + HPH, pakan WPC yang telah diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat diikuti oleh homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar; TSC, pakan WPC yang telah diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat.
a–c Rata-rata dengan huruf superskrip yang berbeda dalam kolom yang sama berbeda secara signifikan ( P  < 0,05).

pH dalam sampel retentat dan permeat lebih rendah dalam sampel yang diolah dengan TSC (TSC: 6,47 dan 6,54; TSC + HPH: 6,52 dan 6,58; HPH + TSC: 6,47 dan 6,53, masing-masing dalam sampel retentat dan permeat) dibandingkan dengan sampel yang diolah dengan CTRL dan HPH, yang memiliki nilai pH 6,55 dalam retentat dan 6,62 dalam permeat. Awalnya, penambahan TSC sedikit meningkatkan pH dalam sampel yang telah diolah terlebih dahulu, konsisten dengan temuan dalam penelitian sebelumnya dengan larutan protein yang serupa (Hebishy et al . 2019 ). Namun, setelah penambahan TSC, pH disesuaikan secara manual menjadi 6,4 pada suhu 22°C dalam semua sampel yang telah diolah terlebih dahulu, menggunakan HCl, untuk menstandardisasi kondisi sebelum MF (yang akhirnya dilakukan pada suhu yang lebih rendah). Ion sitrat dalam TSC, yang merupakan asam lemah, bertindak sebagai agen penyangga, yang berkontribusi terhadap pH yang lebih rendah yang diamati dalam aliran yang diolah dengan TSC setelah MF. Ion-ion ini mengkelat kation divalen seperti Ca 2+ dan Mg 2+ , mengganggu agregat protein yang dimediasi kation, yang selanjutnya dapat memengaruhi keseimbangan pH (Ozcan-Yilsay et al . 2007 ).

Sebaliknya, konduktivitas lebih tinggi dalam sampel yang diolah dengan TSC (TSC: 2,45 mS/cm dalam retentat dan permeat; TSC + HPH: 2,45 dan 2,43 mS/cm; HPH + TSC: 2,47 dan 2,46 mS/cm) dibandingkan dengan perlakuan CTRL dan HPH (1,75 mS/cm dalam retentat dan 1,61 mS/cm dalam permeat). Konduktivitas yang lebih tinggi ini disebabkan oleh kekuatan ionik yang lebih tinggi dari penambahan TSC. Trisodium sitrat terdisosiasi menjadi ion Na + dan sitrat (C6H5O73− ) , meningkatkan konsentrasi ion bebas dalam larutan dan dengan demikian meningkatkan konduktivitas (Fidaleo dan Moresi 2013 ) . Homogenisasi tekanan tinggi, yang merupakan proses mekanis, tidak memengaruhi pH atau keseimbangan ionik dan dengan demikian tidak memengaruhi konduktivitas. Oleh karena itu, perubahan yang diamati dalam pH dan konduktivitas dalam sampel yang diberi TSC dapat dikaitkan semata-mata dengan penambahan TSC dan penyesuaian pH berikutnya.

Komposisi kotor
Sampel pakan WPC direkonstitusi hingga mengandung 2,4% protein dan 4% TS. Kandungan lemak bubuk WPC sekitar 5% berat dalam bentuk kering, yang merupakan ciri khas produk WPC komersial (Svanborg et al . 2015 ; Mehra et al . 2021 ). Sampel pakan yang telah diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat (TSC, TSC + HPH, dan HPH + TSC) menunjukkan kadar abu yang sedikit lebih tinggi, tetapi tidak berbeda secara signifikan ( P  > 0,05), dibandingkan dengan sampel CTRL dan HPH. Peningkatan kecil ini kemungkinan disebabkan oleh penambahan TSC dan penyesuaian pH selama pengolahan, yang memasukkan Na + dan C 6 H 5 O 7 3− , dan proses penyesuaian pH, yang dapat menyumbangkan mineral tambahan ke dalam larutan.

Perlakuan WPC secara signifikan memengaruhi pembagian komponen, seperti yang ditunjukkan oleh komposisi kimia kotor dan profil mineral dalam aliran retentat dan permeat (Tabel 2 ). Total padatan secara signifikan lebih tinggi ( P  < 0,05) dalam retentat CTRL dibandingkan dengan sampel retentat yang telah diolah terlebih dahulu, dengan pengurangan masing-masing sebesar 3,48, 6,09, 6,96 dan 11,3% dalam TSC, HPH, TSC + HPH dan HPH + TSC, relatif terhadap retentat CTRL. Tingkat yang lebih rendah ini menunjukkan bahwa perlakuan meningkatkan transmisi komponen melalui membran, dengan efek terbesar diamati untuk HPH + TSC. Dalam perlakuan HPH + TSC ini, kombinasi HPH diikuti oleh TSC tampaknya meningkatkan permeasi lebih efektif daripada strategi perlakuan lainnya.

Tabel 2. Komposisi kimia kotor dan profil mineral dari sampel pakan, retentat dan permeat yang dihasilkan setelah mikrofiltrasi pakan konsentrat protein whey dengan perlakuan berbeda pada suhu 12,8 ± 1°C.

Ca, kalsium; Cl, ​​klorida; CTRL, kontrol pakan konsentrat protein whey (WPC); HPH + TSC, pakan WPC yang diolah terlebih dahulu dengan homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar diikuti oleh trisodium sitrat; HPH, pakan WPC dihomogenisasi pada 650 bar; K, kalium; Mg, magnesium; Na, natrium; P, fosfor; TSC + HPH, pakan WPC yang diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat diikuti oleh homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar; TSC, pakan WPC yang diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat.
a–d Rata-rata dengan huruf superskrip yang berbeda dalam kolom dan aliran yang sama berbeda secara signifikan ( P  < 0,05).

Kandungan protein dalam retentat CTRL secara signifikan lebih tinggi ( P  < 0,05) dibandingkan dengan retentat sampel yang telah diolah sebelumnya. Retensi protein dalam sampel yang telah diolah sebelumnya berkurang sebesar 9,0%, 7,5%, 8,2% dan 11,5% untuk perlakuan TSC, HPH, TSC + HPH dan HPH + TSC, masing-masing, relatif terhadap retentat CTRL. Protein whey asli, yang memiliki berat molekul berkisar antara 14 hingga 150 kDa, diharapkan dapat menembus membran 1000 kDa yang digunakan dalam penelitian ini. Namun, retensi protein tinggi yang diamati dalam CTRL kemungkinan disebabkan oleh denaturasi dan agregasi protein whey yang diinduksi panas selama produksi WPC, yang menyebabkan peningkatan ukuran agregat protein yang menghambat perjalanannya melalui membran (Levin et al . 2016 ; Mulcahy et al . 2017 ; Ozturk et al . 2022 ; Tanudjaja et al . 2022 ). Perlakuan, terutama yang melibatkan TSC, mengganggu agregat ini, sehingga meningkatkan permeasi protein, terutama pada HPH + TSC. Perlakuan menggunakan HPH juga menunjukkan peningkatan permeasi protein. Peran HPH dalam mengurangi ukuran agregat protein selanjutnya didukung oleh temuan Hebishy et al . ( 2022 ), yang menunjukkan bahwa penerapan homogenisasi pada tekanan antara 5 dan 10 MPa selama proses rehidrasi secara signifikan mengurangi ukuran partikel dispersi konsentrat protein susu, yang mengarah pada peningkatan kelarutan dan stabilitas panas. Hal ini sejalan dengan peningkatan yang diamati dalam permeasi protein di HPH, di mana HPH mengganggu agregat protein, meningkatkan kelarutannya dan memungkinkan transmisi yang lebih tinggi melalui membran.

Perbedaan dalam permeasi protein antara TSC + HPH dan HPH + TSC dapat dikaitkan dengan urutan perlakuan. Dalam TSC + HPH, TSC ditambahkan terlebih dahulu, yang memungkinkan kelasi ion Ca 2+ dan Mg 2+ semalam , yang mengganggu agregat protein yang dimediasi kation. Namun, homogenisasi berikutnya mungkin tidak sepenuhnya mengganggu agregat yang tersisa, karena interaksi yang dimediasi kation hanyalah satu pertimbangan dalam stabilisasi agregat protein. Kekuatan lain, seperti interaksi hidrofobik, ikatan hidrogen, dan jembatan disulfida, mungkin telah lebih menstabilkan agregat, sehingga disagregasi lengkap menjadi tantangan. Sebaliknya, dalam HPH + TSC, homogenisasi diterapkan sebelum perlakuan TSC, yang kemungkinan mengganggu agregat protein yang lebih besar, sehingga memperlihatkan daerah yang sebelumnya terkubur. Penambahan TSC berikutnya kemudian dapat bekerja pada tempat-tempat yang baru terekspos ini, yang mengarah pada kelasi Ca 2+ dan Mg 2+ yang lebih efektif dan disagregasi lebih lanjut dari protein yang teragregasi, yang pada akhirnya menghasilkan permeasi protein yang lebih besar yang diamati untuk perlakuan ini. Dengan demikian, urutan penerapan TSC dan perlakuan homogenisasi dalam HPH + TSC memfasilitasi penguraian agregat protein yang lebih efisien, sehingga meningkatkan permeasi protein.

Dalam hal retensi lemak, CTRL memiliki kandungan lemak yang secara signifikan lebih rendah ( P  < 0,05) (0,78%) daripada TSC (0,92%), HPH (1,00%), TSC + HPH (0,90%) dan HPH + TSC (0,94%). Penelitian kami sebelumnya yang menggunakan bubuk WPC yang sama menunjukkan bahwa 25,1% lemak dalam WPC ini adalah fosfolipid (Mestawet et al . 2024 ). Berdasarkan hal ini, kami berasumsi bahwa perlakuan juga berkontribusi terhadap peningkatan konsentrasi PL dalam retentat. Konsentrasi lemak, dinyatakan sebagai persentase dari total padatan, meningkat sebesar 15%, 22%, 13% dan 17% dalam perlakuan TSC, HPH, TSC + HPH dan HPH + TSC, masing-masing, dibandingkan dengan retentat CTRL. Peningkatan yang nyata dalam kandungan lemak dalam retentat ini kemungkinan besar disebabkan oleh peningkatan permeasi protein dalam sampel yang telah diolah terlebih dahulu, yang mengurangi jumlah total padatan nonlemak, sehingga meningkatkan proporsi relatif lemak sebagai persentase dari total padatan yang tersisa. Kandungan lemak absolut tetap konsisten di seluruh perlakuan, karena tidak ada lemak yang diharapkan dapat menembus membran. Karena partikel lemak terlalu besar untuk menembus membran, konsentrasi relatifnya dalam retentat meningkat saat komponen yang lebih permeabel melewatinya. Dalam aliran permeat sampel yang telah diolah terlebih dahulu, TS dan kandungan protein secara signifikan lebih tinggi ( P  < 0,05) dibandingkan dalam permeat CTRL. Permeat CTRL memiliki TS terendah (2,34%) dan protein (1,04%), sementara TSC, TSC + HPH dan HPH + TSC menunjukkan kandungan TS yang lebih tinggi (2,44–2,49%) dan protein (1,13–1,15%), yang menunjukkan transmisi komponen whey yang lebih luas.

Singkatnya, perbedaan komposisi antara aliran retentat dan permeat menunjukkan dampak perlakuan terhadap kinerja MF WPC (Ozcan-Yilsay et al . 2007 ; Hebishy et al . 2019 ). Penambahan TSC, khususnya dalam kombinasi dengan HPH, memainkan peran penting dalam mengganggu agregat protein yang dimediasi kation, sehingga meningkatkan permeasi protein dan mineral (Ozcan-Yilsay et al . 2007 ; Li et al . 2018 ; Hebishy et al . 2019 ; Jin et al . 2022 ). Urutan perlakuan dalam HPH + TSC, dengan homogenisasi diikuti oleh perlakuan TSC, menghasilkan permeasi protein yang paling luas, yang menyoroti pentingnya urutan perlakuan.

Profil mineral dari berbagai sampel
Dalam sampel pakan WPC, kadar Ca, K, P, dan Mg yang serupa diamati di seluruh perlakuan (Tabel 2 ). Namun, perlakuan yang melibatkan TSC (TSC, TSC + HPH, dan HPH + TSC) menunjukkan konsentrasi Na dan Cl yang lebih tinggi daripada pakan CTRL dan HPH. Peningkatan ini disebabkan oleh penambahan TSC selama perlakuan, yang memasukkan Na, dan penyesuaian pH berikutnya menjadi 6,4 dengan HCl, yang menambahkan Cl. Secara khusus, perlakuan ini menunjukkan kandungan Na 4,6 kali lipat lebih tinggi dan kandungan Cl yang sekitar 23% lebih tinggi. Kandungan Ca, P, Mg, dan K dalam pakan WPC konsisten dengan yang dilaporkan dalam literatur (Smithers 2008 ; Joyce et al . 2017 ; Barone et al . 2020 ).

Dalam aliran retentat untuk perlakuan TSC, TSC + HPH dan HPH + TSC, kandungan Ca secara signifikan lebih rendah ( P  < 0,05) daripada kandungan Ca dalam aliran CTRL, dengan kadar masing-masing 45%, 42% dan 41%, yang dinyatakan sebagai % dari CTRL; nilai yang sesuai untuk Mg masing-masing adalah 43%, 43% dan 39%. Pengurangan kandungan Ca dan Mg dalam aliran retentat setelah perlakuan TSC mendukung hipotesis bahwa TSC mengkelat kation divalen ini, mengganggu agregat protein yang dimediasi kation dan dengan demikian memfasilitasi permeasi protein yang lebih tinggi. Hal ini selanjutnya didukung oleh kandungan Ca dan Mg yang lebih tinggi dalam aliran permeat dari perlakuan ini. Dalam aliran permeat dari sampel yang telah diolah terlebih dahulu dengan TSC, kandungan Ca dan Mg kira-kira 35% dan 32% lebih tinggi daripada sampel CTRL dan HPH. Kandungan Na dalam permeat dari sampel pra-perlakuan TSC lebih dari 3,6 kali lebih tinggi daripada sampel CTRL dan HPH, sementara kandungan Cl adalah 29%, 22% dan 25% lebih tinggi dalam sampel TSC, TSC + HPH dan HPH + TSC, masing-masing, daripada dalam CTRL. Hasil-hasil ini menunjukkan bahwa kemampuan TSC untuk mengkelat ion-ion divalen mengganggu agregat protein dan meningkatkan kinerja MF dengan mengurangi ukuran agregat dan meningkatkan transmisi komponen (Ozcan-Yilsay et al . 2007 ; Hebishy et al . 2019 ; Laursen et al . 2023 ). Namun, kandungan Na dan Cl yang lebih tinggi dalam aliran permeat sampel yang diolah TSC, yang dikaitkan dengan penambahan TSC dan penyesuaian pH menggunakan HCl, mungkin memerlukan pemrosesan lebih lanjut (misalnya nanofiltrasi) untuk mengurangi konsentrasi ini untuk aplikasi tertentu.

Konsentrasi K dan P dalam aliran retentat dari berbagai perlakuan masing-masing sekitar 55 dan 37 mg/100 g, tanpa perbedaan signifikan yang diamati antara perlakuan. Hal ini konsisten dengan nilai yang dilaporkan sebelumnya untuk WPPC (Swaminathan et al . 2021 ; Viswanathan et al . 2021 ). Nilai-nilai ini juga selaras erat dengan yang dilaporkan oleh penelitian lain pada produk WPC (Levin et al . 2016 ; Carter et al . 2021 ; Ozturk et al . 2022 ). Konsistensi dalam kandungan K dan P di seluruh perlakuan mencerminkan kemampuan selektif TSC untuk mengkelat kation divalen seperti Ca 2+ dan Mg 2+ , sementara HPH secara fisik mengganggu agregat protein tanpa mengubah distribusi mineral selama MF berikutnya.

Pembagian komponen antara aliran proses yang berbeda
Pembagian komponen antara retentat dan permeat selama MF dipengaruhi oleh karakteristik membran, faktor konsentrasi, parameter pemrosesan, dan keadaan fisik komponen umpan (Price 2019 ; Carter et al . 2021 ; Salunke et al . 2021 ). Perlakuan umpan WPC memiliki efek signifikan ( P  < 0,05) pada pembagian komponen, sebagaimana dibuktikan oleh perbedaan dalam distribusi TS, protein, dan mineral antara aliran retentat dan permeat (Tabel 2 dan 3 ). Perbedaan yang diukur kemungkinan disebabkan oleh kemampuan TSC untuk menyerap mineral, yang mengganggu agregat protein yang dimediasi kation, dan pengurangan ukuran agregat yang dicapai menggunakan homogenisasi (Ozcan-Yilsay et al . 2007 ; McCarthy et al . 2017 ; Li et al . 2018 ). Semua sampel yang telah diolah terlebih dahulu menunjukkan peningkatan permeasi TS dan protein ke dalam permeat, dibandingkan dengan CTRL, yang menunjukkan retensi tertinggi. Di antara semua perlakuan, HPH + TSC adalah yang paling berdampak, mencapai permeasi TS dan protein tertinggi ke dalam permeat. HPH + TSC menunjukkan permeasi TS dan protein tertinggi ke dalam permeat, menghasilkan retensi TS (42,3%) dan protein (50,1%) terendah dalam retentat, dibandingkan dengan TS 47,4% dan retensi protein 56,5% dalam CTRL. Hasil ini kemungkinan besar disebabkan oleh urutan perlakuan dalam HPH + TSC, di mana homogenisasi dilakukan sebelum penambahan TSC. Homogenisasi secara efektif mengganggu agregat protein, memperlihatkan situs reaktif yang memfasilitasi kelasi berikutnya oleh TSC, sehingga meningkatkan disagregasi protein dan meningkatkan permeasi selama MF.

Tabel 3. Pembagian komponen antara aliran retentat dan permeat setelah mikrofiltrasi pakan konsentrat protein whey dengan perlakuan berbeda pada suhu 12,8 ± 1°C.

CTRL, pakan kontrol konsentrat protein whey (WPC); HPH + TSC, pakan WPC yang diolah terlebih dahulu dengan homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar diikuti oleh trisodium sitrat; HPH, pakan WPC dihomogenisasi pada 650 bar; TSC + HPH, pakan WPC yang diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat diikuti oleh homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar; TSC, pakan WPC yang diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat.
a–e Berarti dengan huruf superskrip yang berbeda dalam kolom dan aliran yang sama secara signifikan berbeda ( P  < 0,05).

Pembagian komponen antara retentat dan permeat dihitung melalui neraca massa, yang juga memperhitungkan material yang terkait dengan membran. Penting untuk dicatat bahwa jumlah pembagian komponen antara retentat dan permeat tidak sama dengan 100%, karena beberapa komponen melekat pada permukaan membran atau berkontribusi pada lapisan pengotoran pada/di dalam membran selama MF. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa agregat yang lebih kecil, yang terbentuk karena perlakuan, lebih mungkin terakumulasi pada permukaan membran, yang dapat berkontribusi pada pengotoran dan sedikit mengurangi efisiensi transfer komponen (Baldasso et al . 2011 ; France et al . 2021b ; Swaminathan et al . 2021 ; Tanudjaja et al . 2022 ). Meskipun demikian, peningkatan permeasi yang diamati pada sampel yang telah diolah sebelumnya menunjukkan bahwa, meskipun ada potensi pengotoran, perlakuan tersebut meningkatkan transmisi melintasi membran dengan meningkatkan disagregasi protein dan mengurangi ukuran agregat.

Meskipun ada perbedaan signifikan ( P  < 0,05) dalam tingkat partisi lemak di antara semua retentat, transmisi lemak ke dalam permeat tidak berbeda secara signifikan ( P  > 0,05) antara perlakuan, yang menunjukkan efektivitas membran dalam menahan lemak. Kandungan protein tinggi dalam aliran retentat menunjukkan bahwa, meskipun ada perlakuan, beberapa material agregat tetap ada. Pengamatan ini menyoroti bahwa agregasi tidak hanya didorong oleh interaksi kation tetapi juga melibatkan gaya stabilisasi lainnya, termasuk interaksi hidrofobik, ikatan hidrogen dan pembentukan jembatan disulfida, yang tidak dapat sepenuhnya dipisahkan oleh kelasi atau HPH saja (Fox et al . 2015 ). Akibatnya, meskipun perlakuan TSC dan HPH secara efektif mengganggu agregat yang dimediasi kation dan mengurangi ukuran agregat, mereka tidak cukup untuk mengganggu semua agregat karena adanya interaksi stabilisasi tambahan ini.

Profil protein dari sampel proses
Elektroforesis gel poliakrilamid-natrium dodecyl sulfat
Penilaian visual protein melalui SDS-PAGE mengungkapkan profil protein kompleks di seluruh sampel, yang terutama dicirikan oleh kelimpahan tinggi protein berat molekul rendah, seperti α-laktalbumin (α-la) dan β-lg, dalam kisaran 10–20 kDa (Gambar 2 ). Dalam kondisi nonreduksi, intensitas protein yang tidak terpecahkan rendah dalam sampel pra-perlakuan TSC (TSC, TSC + HPH dan HPH + TSC) dari pakan WPC dan retentat MF, yang menunjukkan peran agen khelasi dalam disagregasi protein. Sebuah studi yang menganalisis material agregat berat molekul tinggi yang tidak terpecahkan ini dengan proteomik berbasis kromatografi cair–spektrometri massa tandem (LC–MS/MS) mengidentifikasi 36 jenis protein yang berbeda, termasuk laktoferin (LF), imunoglobulin (Ig) dan bovine serum albumin (BSA; Xiong et al . 2021 ).

Dalam kondisi nonreduksi, dalam gel umpan WPC, lajur dengan sampel pra-perlakuan TSC (TSC, TSC + HPH, dan HPH + TSC) menunjukkan pengurangan agregasi, khususnya dengan HPH + TSC yang tidak memiliki pita atau tanda-tanda lain dari protein agregat antara ~20 dan 50 kDa. Pada gel retentat dalam kondisi nonreduksi, protein yang tidak terpecahkan dengan berat molekul >250 kDa lebih intens dalam CTRL dan HPH dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Protein-protein ini adalah komponen utama dari protein kompleks/agregat (Xiong et al . 2021 ; Ozturk et al . 2022 ). Dalam kondisi nonreduksi, lajur yang dimuat dengan sampel retentat dari umpan pra-perlakuan (TSC, HPH, TSC + HPH, dan HPH + TSC) menunjukkan pengurangan agregasi, dengan efek paling nyata pada HPH + TSC dibandingkan dengan retentat CTRL. Protein dengan berat molekul rendah (α-la dan β-lg) dan tinggi (Ig dan xantin oksidase) secara signifikan kurang melimpah dalam sampel retentat yang telah diolah terlebih dahulu dibandingkan dengan CTRL. Pengurangan intensitas pita ini menunjukkan bahwa pengolahan, khususnya dengan TSC, meningkatkan disosiasi protein agregat dan mengurangi retensi mereka dalam retentat. Trisodium sitrat bertindak sebagai agen khelasi, mengikat kation divalen seperti Ca2 + dan Mg2 + , yang terlibat dalam agregasi protein yang dimediasi kation (Ozcan-Yilsay et al . 2007 ; McCarthy et al . 2017 ). Dengan mengkelat kation-kation ini, TSC mengganggu jembatan ionik yang menstabilkan agregat protein, yang mengarah pada disosiasi dan pembentukan partikel protein yang lebih kecil. Pengurangan ukuran agregat ini meningkatkan transmisi protein, selanjutnya mengurangi retensi dalam retentat yang dihasilkan.

Kehadiran kompleks protein yang belum terpecahkan dalam sumur sampel pra-perlakuan TSC menunjukkan bahwa agregasi tidak semata-mata dimediasi oleh kation. Selain itu, homogenisasi meningkatkan permeasi melalui pengurangan ukuran, tetapi tidak memisahkan kompleks protein yang terkait secara kimia, sebagaimana dibuktikan oleh protein yang belum terpecahkan >250 kDa. Dalam kondisi reduksi, intensitas pita lebih tinggi untuk semua protein dalam retentat CTRL dibandingkan dengan retentat dari umpan pra-perlakuan. Tidak ada perbedaan yang jelas dalam intensitas pita protein antara sampel retentat dari berbagai umpan pra-perlakuan dalam kondisi reduksi.

Dalam gel yang diisi dengan sampel permeat, intensitas dan jumlah pita yang terlihat lebih besar dalam sampel yang dihasilkan dari sampel yang telah diolah sebelumnya dibandingkan dengan sampel CTRL. Dalam kondisi nonreduksi, dalam lajur yang diisi dengan CTRL, pita yang dapat diidentifikasi dengan jelas adalah α-la dan β-lg, dengan pita intensitas rendah pada 150 kDa yang kemungkinan besar mewakili Ig. Dalam sampel yang telah diolah sebelumnya, selain α-la, β-lg, dan Ig, pita tambahan muncul sekitar 20 kDa, kemungkinan fragmen kasein, dan 55 kDa, yang sesuai dengan BSA dan/atau LF (Saxena et al . 2009 ; Svanborg et al . 2015 ; Mehra et al . 2021 ). Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa selama MF whey yang dihasilkan dari pemrosesan keju, yang telah mengalami beberapa perlakuan panas, sebagian besar Ig dikaitkan dengan protein lain dan tertahan dalam aliran retentat MF (Xiong et al . 2021 ). Ini bisa menjadi alasan rendahnya intensitas pita Ig dalam CTRL. Dalam sampel yang dihasilkan setelah perlakuan, intensitas pita yang mewakili Ig tinggi, memberikan bukti bahwa perlakuan pakan WPC secara efektif mencapai disosiasi protein dan akhirnya meningkatkan permeasi Ig ke dalam aliran permeat.

Kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik
Seperti yang diharapkan, protein yang paling melimpah dalam sampel dari berbagai perlakuan adalah β-lg (Tabel 4 ), yang merupakan sekitar setengah dari protein whey dalam susu sapi (Levin et al . 2016 ; Swaminathan et al . 2021 ; Ozturk et al . 2022 ). Sampel retentat dari TSC, TSC + HPH, dan HPH + TSC menunjukkan kadar α-la dan β-lg yang secara signifikan lebih rendah ( P  < 0,05) dibandingkan dengan CTRL dan HPH. Hal ini menunjukkan bahwa TSC, melalui sifat khelasi dan sekuestrasinya, melepaskan protein-protein ini dari matriks protein agregat, yang memungkinkan permeasi dan reduksi selanjutnya dalam aliran retentat (McCarthy et al . 2017 ; Li et al . 2018 ; Hebishy et al . 2019 ; Jin et al . 2022 ). Lebih jauh lagi, dalam retentat, rasio α-la terhadap β-lg berkurang secara signifikan ( P  < 0,05) dalam TSC, TSC + HPH dan HPH + TSC dibandingkan dengan CTRL dan HPH, yang menunjukkan bahwa α-la sebagian besar dilepaskan dari matriks protein agregat. Dalam aliran permeat, kadar α-la secara signifikan lebih tinggi ( P  < 0,05) dalam TSC + HPH dan HPH + TSC daripada dalam CTRL dan perlakuan lainnya, konsisten dengan rasio α-la terhadap β-lg yang lebih rendah yang diamati dalam aliran retentat. Ini menunjukkan peningkatan permeasi α-la ke dalam aliran permeat karena perlakuan WPC. Selain itu, kadar β-lg secara signifikan lebih tinggi ( P  < 0,05) dalam sampel yang telah diolah sebelumnya daripada CTRL, yang selanjutnya membuktikan dampak perlakuan WPC pada mekanisme partisi komponen. Namun, rasio α-la terhadap β-lg tidak menunjukkan variasi signifikan ( P  > 0,05) antara perlakuan yang berbeda. Analisis kami menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan ( P  > 0,05) dalam kandungan glikomakropeptida (GMP) antara perlakuan yang berbeda dalam setiap aliran. Ozturk dkk . ( 2022 ) mendeteksi sejumlah kecil κ-kasein dalam WPPC. Kandungan yang ditentukan dalam penelitian ini kemungkinan mencakup GMP dan residu κ-kasein, karena keduanya diketahui ikut keluar menggunakan metode yang digunakan (van der Schaaf dkk . 2024 ).

Tabel 4. Profil protein dari sampel pakan, retentat dan permeat yang dihasilkan setelah mikrofiltrasi pakan konsentrat protein whey dengan perlakuan berbeda pada suhu 12,8 ± 1°C.

CTRL, pakan kontrol konsentrat protein whey (WPC); GMP, glikomakropeptida; HPH + TSC, pakan WPC yang telah diolah terlebih dahulu dengan homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar diikuti oleh trisodium sitrat; HPH, pakan WPC dihomogenisasi pada 650 bar; TSC + HPH, pakan WPC yang telah diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat diikuti oleh homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar; TSC, pakan WPC yang telah diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat; α-la, α-laktalbumin; β-lg, β-laktoglobulin.
a–d Rata-rata dengan huruf superskrip yang berbeda dalam kolom dan aliran yang sama berbeda secara signifikan ( P  < 0,05). Profil protein dari semua sampel dianalisis menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik (RP-HPLC) dengan sistem LC Agilent 1220 Infinity II.

Perbedaan yang diamati dalam mekanisme partisi protein whey utama, dengan peningkatan permeasi ke aliran permeat, menghadirkan peluang baru untuk meningkatkan hasil WPI. Selain itu, proses ini memperkaya komponen penting seperti PL dan protein terkait MFGM dalam aliran retentat, akibatnya meningkatkan nilai retentat untuk aplikasi potensial dalam mengembangkan bahan-bahan khusus. Bahan-bahan ini dapat menemukan kegunaan dalam pengayaan formula bayi, serta dalam produk yang disesuaikan untuk nutrisi lansia dan olahraga, karena efek biologis, fisiologis, terapeutik dan sifat tekno-fungsionalnya yang signifikan (Levin et al . 2016 ; Córdova-Dávalos et al . 2019 ; Barone et al . 2020 ; Ozturk et al . 2022 ).

Denaturasi protein whey
Jumlah protein yang diendapkan, dinyatakan sebagai % dari total protein, bervariasi secara signifikan ( P  < 0,05) di antara perlakuan dan aliran (Tabel 5 ). Umpan HPH + TSC menunjukkan sedimentasi terendah (48,3%), secara signifikan lebih rendah ( P  < 0,05) daripada CTRL (51,7%) dan umpan perlakuan lainnya. Tingkat sedimentasi yang lebih rendah dalam HPH + TSC ini menunjukkan pengurangan agregasi protein dan disebabkan oleh kombinasi perlakuan HPH dan TSC. Sementara homogenisasi diketahui menyebabkan gangguan fisik pada agregat protein whey, penambahan TSC berikutnya dalam perlakuan HPH + TSC, dikombinasikan dengan waktu penyimpanan yang diperpanjang, akan menciptakan situs aktif tambahan untuk TSC, memfasilitasi disagregasi agregat yang dimediasi kation yang lebih luas dibandingkan dengan menggunakan HPH saja. Proporsi protein terdenaturasi dalam CTRL (51,7%) sejalan dengan kisaran yang dilaporkan oleh Sodini et al . ( 2006 ), yang melaporkan 10–53% protein agregat dalam WPC, sementara hasil studi saat ini lebih tinggi daripada yang dilaporkan oleh Barone et al . ( 2020 ), sebesar 31,4%. Perbedaan dalam tingkat protein whey asli dan terdenaturasi ini dapat dikaitkan dengan variasi dalam proses pembuatan WPC, seperti yang disorot dalam studi sebelumnya (Sodini et al . 2006 ; Walstra et al . 2006 ; Fox et al . 2015 ; Barone et al . 2020 ; Laursen et al . 2023 ). Faktor-faktor seperti intensitas perlakuan panas, kondisi pH selama pemrosesan dan metode pengeringan yang digunakan dalam produksi WPC dapat secara signifikan memengaruhi tingkat denaturasi dan agregasi protein, yang berpotensi menjelaskan kandungan protein agregat yang sedikit lebih tinggi yang diukur dalam studi kami.

Tabel 5. Ukuran partikel dan protein yang terendapkan pada pH 4,6 sebagai fungsi dari total protein, dalam aliran umpan, retentat, dan permeat yang dihasilkan setelah mikrofiltrasi konsentrat protein whey dengan berbagai perlakuan pada suhu 12,8 ± 1°C.

CTRL, pakan kontrol konsentrat protein whey (WPC); HPH + TSC, pakan WPC yang diolah terlebih dahulu dengan homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar diikuti oleh trisodium sitrat; HPH, pakan WPC dihomogenisasi pada 650 bar; TSC + HPH, pakan WPC yang diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat diikuti oleh homogenisasi tekanan tinggi pada 650 bar; TSC, pakan WPC yang diolah terlebih dahulu dengan trisodium sitrat.
a–d Berarti dengan huruf superskrip yang berbeda dalam kolom yang sama dan dalam aliran yang sama secara signifikan berbeda ( P  < 0,05).

Di antara aliran retentat, CTRL menunjukkan sedimentasi tertinggi (65%, P  < 0,05), sedangkan HPH + TSC menunjukkan yang terendah (43,4%, P  < 0,05), mengikuti pola yang mirip dengan yang diamati dalam aliran umpan. Retentat dari CTRL, TSC, HPH, dan TSC + HPH mengandung proporsi material terdenaturasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan HPH + TSC, konsisten dengan analisis gel SDS-PAGE (Gambar 2 ). Kehadiran partikel agregat dan terdenaturasi yang lebih besar kemungkinan berkontribusi pada sedimentasi yang lebih tinggi dalam sampel ini, yang mengarah pada retensi protein terukur yang lebih tinggi selama MF. Sebaliknya, agregat yang lebih kecil dan protein asli lebih mungkin meresap, konsisten dengan temuan dari penelitian sebelumnya (McCarthy et al . 2017 ; Price 2019 ; Reig et al . 2021 ). Pada aliran permeat, CTRL menunjukkan sedimentasi yang jauh lebih rendah ( P  < 0,05) dibandingkan sampel permeat dari umpan yang telah diolah terlebih dahulu, yang menunjukkan bahwa peningkatan permeasi protein yang dicapai melalui perlakuan TSC dan HPH sebagian besar melibatkan agregat yang lebih kecil.

Distribusi ukuran partikel
Ukuran partikel sampel dari berbagai perlakuan dan aliran ditentukan oleh hamburan cahaya dinamis (DLS) dan data disajikan sebagai nilai diameter rata-rata intensitas z. Sampel menunjukkan distribusi bimodal (Gambar 3 ), tetapi analisis lebih lanjut dengan fungsi korelogram-korelasi mengungkapkan bahwa lebih dari 99,9% partikel memiliki distribusi unimodal, dengan puncak kedua disebabkan oleh kurang dari 0,01% partikel yang lebih besar yang memancarkan intensitas cahaya tinggi. Oleh karena itu, distribusi yang dilaporkan adalah unimodal, dengan nilai rata-rata z berbasis intensitas yang disediakan.

Dalam penelitian ini, perlakuan pakan WPC secara signifikan memengaruhi ukuran partikel. Sampel yang dikenai HPH, TSC + HPH dan HPH + TSC menunjukkan ukuran partikel yang secara signifikan lebih kecil ( P  < 0,05) daripada CTRL dan TSC, yaitu 100–150 nm lebih kecil (Tabel 5 ). Menariknya, pakan pra-perlakuan TSC menunjukkan ukuran partikel yang sedikit lebih besar dibandingkan dengan CTRL, yang dapat dikaitkan dengan sensitivitas pengukuran DLS terhadap hamburan cahaya oleh proporsi kecil agregat besar. Meskipun demikian, kelasi ion divalen (misalnya Ca 2+ dan Mg 2+ ) oleh TSC kemungkinan mengurangi stabilitas agregat, sehingga meningkatkan kelarutan protein dan berkontribusi terhadap penurunan keseluruhan ukuran partikel di seluruh perlakuan. Ukuran partikel besar yang diamati dalam pakan WPC mungkin terkait dengan denaturasi dan agregasi yang disebabkan oleh panas selama pembuatan WPC, sebuah fenomena yang terdokumentasi dengan baik dalam produk bubuk protein whey (Mulcahy et al . 2017 ; Hebishy et al . 2019 ; Yates et al . 2022 ).

Data ukuran partikel untuk sampel umpan dan retentat di berbagai perlakuan menunjukkan adanya agregat protein yang lebih besar, konsisten dengan ukuran partikel WPC 670 nm yang dilaporkan oleh Barone et al . ( 2020 ). Sebaliknya, perbedaan signifikan ( P  < 0,05) dalam ukuran partikel diamati dalam sampel permeat di berbagai perlakuan. Namun, ukuran partikel terkecil tercatat untuk HPH + TSC, yang menunjukkan bahwa efek gabungan homogenisasi yang diikuti oleh perlakuan TSC memfasilitasi disagregasi agregat lebih lanjut, menghasilkan ukuran partikel yang lebih kecil, yang akhirnya menghasilkan permeasi protein yang lebih tinggi. Ukuran partikel yang diukur dalam sampel permeat untuk penelitian saat ini selaras dengan penelitian sebelumnya, termasuk Mulcahy et al . ( 2017 ), yang melaporkan 20–30 nm, Ryan et al . ( 2012 ), dengan 43–66 nm, dan Dissanayake dan Vasiljevic ( 2009 ), yang mengamati ukuran partikel berkisar antara 10 hingga 100 nm, sambil mengkarakterisasi sifat WPI, agregat asli dan larut WPI, dan protein whey, masing-masing.

KESIMPULAN
Studi ini menunjukkan bahwa pra-perlakuan WPC secara efektif mengurangi agregasi protein, yang mengarah pada peningkatan fluks permeat dan partisi komponen yang dimodifikasi selama MF. Pengurangan kandungan protein, ukuran partikel dan konsentrasi mineral dalam retentat MF dari sampel yang telah diolah sebelumnya merupakan bukti pengurangan agregasi protein. Di antara perlakuan yang dipelajari, penggunaan gabungan HPH dan TSC adalah yang paling efektif dalam memodifikasi transmisi komponen selama MF berikutnya. Efektivitas ini dikaitkan dengan tindakan homogenisasi berurutan, diikuti oleh perlakuan TSC, yang kemungkinan mengekspos situs aktif tambahan bagi TSC untuk mengikat mineral, yang selanjutnya meningkatkan disagregasi protein. Memang, konsentrasi kalsium dan magnesium yang secara signifikan lebih rendah dalam retentat sampel yang diolah dengan TSC menggarisbawahi peran kation ini dalam memediasi agregasi protein. Studi ini merupakan studi pertama yang menunjukkan peningkatan permeasi protein selama MF WPC sebagai hasil dari perawatan tertarget yang dirancang untuk memungkinkan pengayaan senyawa bioaktif, seperti PL, dalam aliran retentat, yang berkontribusi terhadap valorisasi dan mendorong inovasi berkelanjutan dalam pengembangan bahan baku susu.